2024/05/14 使用BMG reader即時監測iPSC心臟組織之鈣離子變化
新藥開發需進行全面性測試，必須具備對於人體有正面效益及沒有健康危害的特性，但動物模型對於藥物可能產生不同的反應。為此，研究人員尋找更合適的體外系統，盡可能模擬人體組織或器官的生理狀況。傳統方式的2D細胞培養，有利於初步篩選。然而，3D細胞培養方式可提供數據更加接近體內組織結果，並最大限度減少來自2D細胞培養結果之誤導。工程心臟組織(Engineered heart tissues, EHTs)是由人類誘導型多功能幹細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)分化的心肌細胞製造而成。我們發現人類心肌和 EHTs 都會以相似的速率自發性跳動。於本篇中將介紹如何使用這個3D模型來分析藥物處理下，對於組織中鈣離子的變化，藉此篩選出可能引起不良副作用的藥物。當作動電位轉移至細胞膜上，膜將會進行去極化(-80mV)，去極化結果會導致電位的改變使離子通道被打開，鈣離子湧入細胞內，進一步引發鈣離子由內部肌漿網狀結構(Sarcoplasmic Reticulum, SR)迅速釋放。鈣離子增加會進一步活化鈣離子依賴性收縮蛋白作用。BMG CLARIOstar plus全功能盤式判讀儀可偵測短時間內快速的變化，每秒讀取100個數據(相當於每0.01秒可讀取一個數據點)。鈣離子染劑Fluo-4可用於標記細胞質中鈣離子，可偵測鈣離子短時間內的變化。
動力學設定：
結果與討論：
由鈣離子染劑的實驗結果可以看出螢光強度的週期性變化很明顯(圖一A)。數據經由平均數或者快速傅立葉變換(Fast Fourier Transfer, FFT)分析，鈣離子變化數值(於十次或者更多次)重疊圖鈣離子變化曲線(圖一B)，與人類心肌有相似的結果(圖一C)。
圖一 使用iPSC所衍生出的3D心臟組織及Fluo-4鈣離子螢光染劑測量鈣離子的瞬間變化。(A)CLARIOstar plus盤式判讀儀偵測鈣離子瞬間變化週期，藉由鈣離子變化影響心臟收縮。(B)10次鈣離子瞬間變化疊圖，每一個為單次心臟跳動。(C)鈣離子短時間內的變化平均分布(bar=標準誤差)。
當EHTs分別以多種類型的藥物處理後，鈣離子會產生明顯的變化，進一步產生興奮收縮聯合作用(excitation contraction coupling, ECC)，鈣離子作為第二訊息傳遞者(second messenger)，藉由鈣離子濃度調節心臟收縮(圖二)。
圖二 EC-coupling & regulation. LCC: L-type Ca channel, RyR: Ryanodine receptor NCX: Na-Ca exchanger, PDE: Phosphodiesterase III, PKA: Protein kinase A, TnC/I: Troponin C/I, SERCA: SR Ca pump, PLP: Phospholamban, b1AR: beta adrenergic receptor, AC: Adenylyl cyclase, M2R: M2 Receptor, CUP Ca uniporter.
於不同濃度的Cisapride 及Thapsigargin，兩藥物被認為不會影響鈣離子變化，有相似的鈣離子變化特性；以兩個已知會影響鈣離子濃度藥物(E4031 and Nifedipine)，則呈現出明顯的離子濃度依賴性於鈣變化圖型中(圖三)。
圖三 鈣離子短時間變化曲線(Calcium Transient Profiles)。人類 EHTs分別以不同濃度Cisapride, E4031, Nifedipine, Thapsigargin處理。
部分數據指出，有些從市場上撤回的藥物改變人類的EHTs內鈣離子傳遞，長期進行治療下，可能會導致心律不整或者心肌明顯纖維化。結果顯示於早期藥物篩選中，使用人類EHTs進行興奮收縮聯合作用(ECC)分析可用來預測藥物潛在性安全問題。
結論：
利用EHTs來自各種不同個體對於毒物或藥物的敏感性的特性，未來將可能成為重要的工具，用於開發更安全、更加有效個人化治療。CLARIOstar plus全功能盤式判讀儀能夠在一秒內讀取100筆數據。能夠在極短時間的動力學反應中，實時偵測在藥物刺激下引發興奮收縮聯合作用(ECC)。
原廠文章：Real-time calcium flux measurements in iPSC derived 3D heart tissue (2014)
材料方法
CLARIOstar plus全功能盤式判讀儀
Fluo-4 (Life Technologies)
3D tissue culture micro chamber or plates, MC-8TM or MC-96TM respectively (InvivoSciences)
使用 CLARIOstar plus進行鈣指示劑測量
使用市售染劑分析鈣離子變化（Fluo-4-AM，Life Technologies）。將組織浸泡在含有Fluo-4-AM (15 μM) 及Pluronic F127 Tyrodes溶液於37 °C 環境中45到60分鐘。經顯微鏡觀察確定樣本染色，即以Tyrodes溶液替換並於37 °C培養20分鐘，樣本完成準備後以CLARIOstar plus進行研究(儀器設定見下方)，同樣的方式於可使用2D培養實驗中追蹤鈣離子的變化。
CLARIOstar plus儀器設定：
CLARIOstar plus全功能盤式判讀儀
Fluo-4 (Life Technologies)
3D tissue culture micro chamber or plates, MC-8TM or MC-96TM respectively (InvivoSciences)
使用 CLARIOstar plus進行鈣指示劑測量
使用市售染劑分析鈣離子變化（Fluo-4-AM，Life Technologies）。將組織浸泡在含有Fluo-4-AM (15 μM) 及Pluronic F127 Tyrodes溶液於37 °C 環境中45到60分鐘。經顯微鏡觀察確定樣本染色，即以Tyrodes溶液替換並於37 °C培養20分鐘，樣本完成準備後以CLARIOstar plus進行研究(儀器設定見下方)，同樣的方式於可使用2D培養實驗中追蹤鈣離子的變化。
CLARIOstar plus儀器設定：
動力學設定：
結果與討論：
由鈣離子染劑的實驗結果可以看出螢光強度的週期性變化很明顯(圖一A)。數據經由平均數或者快速傅立葉變換(Fast Fourier Transfer, FFT)分析，鈣離子變化數值(於十次或者更多次)重疊圖鈣離子變化曲線(圖一B)，與人類心肌有相似的結果(圖一C)。
圖一 使用iPSC所衍生出的3D心臟組織及Fluo-4鈣離子螢光染劑測量鈣離子的瞬間變化。(A)CLARIOstar plus盤式判讀儀偵測鈣離子瞬間變化週期，藉由鈣離子變化影響心臟收縮。(B)10次鈣離子瞬間變化疊圖，每一個為單次心臟跳動。(C)鈣離子短時間內的變化平均分布(bar=標準誤差)。
當EHTs分別以多種類型的藥物處理後，鈣離子會產生明顯的變化，進一步產生興奮收縮聯合作用(excitation contraction coupling, ECC)，鈣離子作為第二訊息傳遞者(second messenger)，藉由鈣離子濃度調節心臟收縮(圖二)。
圖二 EC-coupling & regulation. LCC: L-type Ca channel, RyR: Ryanodine receptor NCX: Na-Ca exchanger, PDE: Phosphodiesterase III, PKA: Protein kinase A, TnC/I: Troponin C/I, SERCA: SR Ca pump, PLP: Phospholamban, b1AR: beta adrenergic receptor, AC: Adenylyl cyclase, M2R: M2 Receptor, CUP Ca uniporter.
於不同濃度的Cisapride 及Thapsigargin，兩藥物被認為不會影響鈣離子變化，有相似的鈣離子變化特性；以兩個已知會影響鈣離子濃度藥物(E4031 and Nifedipine)，則呈現出明顯的離子濃度依賴性於鈣變化圖型中(圖三)。
圖三 鈣離子短時間變化曲線(Calcium Transient Profiles)。人類 EHTs分別以不同濃度Cisapride, E4031, Nifedipine, Thapsigargin處理。
部分數據指出，有些從市場上撤回的藥物改變人類的EHTs內鈣離子傳遞，長期進行治療下，可能會導致心律不整或者心肌明顯纖維化。結果顯示於早期藥物篩選中，使用人類EHTs進行興奮收縮聯合作用(ECC)分析可用來預測藥物潛在性安全問題。
結論：
利用EHTs來自各種不同個體對於毒物或藥物的敏感性的特性，未來將可能成為重要的工具，用於開發更安全、更加有效個人化治療。CLARIOstar plus全功能盤式判讀儀能夠在一秒內讀取100筆數據。能夠在極短時間的動力學反應中，實時偵測在藥物刺激下引發興奮收縮聯合作用(ECC)。
原廠文章：Real-time calcium flux measurements in iPSC derived 3D heart tissue (2014)
