2024/06

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在科學研究中，顯微鏡是一個不可或缺的工具，讓我們能夠深入探索微觀世界的奧秘。顯微鏡也有不同類型，具有獨特的功能和應用。一般顯微鏡主要由目鏡、物鏡、載物台組成，透過物鏡將載物台的物體放大，再透過目鏡觀察被放大的影像(圖一)。本文中將介紹三種常見的顯微鏡：正立顯微鏡、倒立顯微鏡和解剖顯微鏡。不同顯微鏡其獨特的結構在不同的觀察需求下發揮著重要作用，讓我們來深入了解它們的應用。

(圖一, 顯微鏡基本原理)

正立顯微鏡是最常見的顯微鏡之一，光源通常從底部或物鏡下方照射到樣本上方。當光線穿過樣本時，它會被樣本的結構或成分吸收、散射或折射，這些影像會通過物鏡放大，最終通過目鏡進入觀察者的眼睛。正立顯微鏡通常用於觀察透明、平面樣本，例如組織玻片等。通常用於學術研究、實驗室工作以及教育目的。(圖二)
 

(圖二,正立顯微鏡)

倒立顯微鏡的光源基本上位於上方，和正立顯微鏡不同的是，倒立顯微鏡物鏡位於載物台的下方。這種設計讓觀察者可以在樣本上方進行操作，例如添加液體。倒立顯微鏡則更適合觀察液體樣本或需要進行操作的樣本，它的設計允許在樣本載台放置培養皿或其他容器。倒立顯微鏡會搭配相位差板，可以增強透明樣本的對比度，使細微的結構和特徵更容易觀察到。通常用於細胞研究和液態樣本研究。(圖三)

(圖三,倒立顯微鏡)

解剖顯微鏡的光源通常也位於顯微鏡的上方再反射回目鏡。它的設計通常比其他顯微鏡更堅固，並具有較大的工作空間，以容納大型樣品。解剖顯微鏡的光源設計旨在提供充足的光線，以使觀察者能夠清楚地看到樣本的細節，且看到立體的影像。由於解剖顯微鏡通常用於觀察大型、不透明的樣本，例如生物組織或昆蟲標本，因此光源的強度和方向非常重要，以確保觀察者可以獲得清晰的影像。通常用於解剖學研究、醫學診斷和教學等。(圖四)
 

(圖四,解剖顯微鏡)

除了上述提到的三種常見顯微鏡之外皆為明視野顯微鏡，還可以搭配其他模組進行變化，如螢光顯微鏡和相位差顯微鏡等等。搭配不同的模組選擇適合的顯微鏡取決於樣本的特性和觀察的需求。透過這些顯微鏡，科學家們能夠觀察到更細微的結構，探索物質的奧秘，為科學研究提供重要的支持和貢獻！

背景介紹
哺乳動物細胞和昆蟲細胞等蛋白質生產系統廣泛應用於生命科學、生物技術和生物醫學產業。值得注意的是，像 SF9 細胞株這樣的昆蟲細胞由於具有以下優點而廣泛應用於蛋白質表達：易於培養、放大過程中具有成本效益，與哺乳動物細胞相比對滲透壓的耐受性更高。然而，確保高品質的蛋白質生產需要監測細胞濃度(Cell concentration)和存活率(Viability)，以維持健康的細胞培養和穩健的蛋白質生產。當與適當的染色方法配合使用時，LUNA-FX7™ 自動細胞計數器可以為此目的提供一種便捷的技術。本研究旨在比較不同的染劑(Dye)種類，並推薦用於評估 SF9 細胞存活率的最佳染劑。

染色步驟
SF9 細胞以Logos Biosystems原廠染劑進行染色：
　● Trypan Blue (TB) Stain, 0.4% (T13001)
　● Acridine Orange (AO) / Propidium Iodide (PI) Stain (F23001)
　● Fluorescein Diacetate (FDA) / Propidium Iodide (PI) Stain (F23214) 

Trypan blue staining
1. Mix:
　● 10 μL TB, 0.4%
　● 10 μL cell sample
2. Load 10 μL of stained cells.
3. Perform analysis using the LUNA-FX7™.
*Default protocol

Fluorescence staining
1. Mix:
　● 2 μL pre-mixed dyes or 1μL per individual dye
　● 18 μL cell sample
2. Load 10 μL of stained cells.
3. Perform analysis using the LUNA-FX7™.
*注意：SF9細胞可能根據使用的染劑不同，表現出不同的螢光強度。請依據需求進行參數調整。

用於存活率測定的染劑



用於 SF9 細胞評估的最佳染劑
TB 和 FDA/PI 均可用於 SF9 細胞染色以進行存活率測量(圖1A)，但 FDA/PI 是首選。

TB 通常用於評估 SF9 細胞的細胞濃度和存活率。然而，建議避免在貼壁培養時使用TB，因為這需要在繼代培養(Subculturing)過程中進行物理操作。SF9 細胞容易受到機械力(Mechanical force)和攪動(Agitation)的影響，導致在貼壁培養時產生細胞碎片(Cellular debris)。細胞碎片可能導致 TB 與樣品中的各種顆粒產生非特異性結合，而這個問題在懸浮培養中可能不太明顯。
在評估螢光染劑組合時，將U937 細胞以 AO/PI 染劑組合進行染色，作為驗證染劑性能的參考。雖然 AO/PI 染劑通常對大多數哺乳動物細胞有效，但其功效可能因不同細胞類型而異。事實上，用 AO/PI 染劑組合染色的 SF9 細胞表達出的是低訊號強度。本研究中推測，這種差異可能是因為與哺乳動物細胞相比，昆蟲細胞的基因組大小相對較小所致。為了克服這個問題，與哺乳動物細胞典型的Exposure level參數 5 相比，建議將 GF 和 RF 的 Exposure level 參數皆調整為 7。雖然 PI 表達了足夠強的訊號，但調整 Exposure level 參數後 AO 的訊號強度仍然較低。儘管所有細胞都被成功標記，但微弱的 AO 訊號可能使得整體計數結果表現較差(圖1B)。

考慮到上述問題，在測試的染劑種類中，FDA/PI 是 SF9 細胞計數和存活率評估最有效的染劑。 FDA 依賴細胞酯酶(Cellular esterase )活性，該活性對酵母菌和昆蟲細胞等各種細胞類型都有效，無論基因組大小如何。 FDA 可以在細胞質(Cytosol)中表達高訊號，此時需要將 GF Exposure level參數降低至 1。

圖 1. (A) 使用 TB、AO/PI 和 FDA/PI 對 SF9 進行染色的結果。 SF9 細胞可被 TB 和 FDA/PI 有效染色，而 AO/PI 染色則表達較低綠螢光訊號。(B) AO/PI和FDA/PI染色的SF9細胞與AO/PI染色的U937細胞之染色結果比較。每個樣品都應用了不同的 LED 等級。
Tag：所有通道(螢光和明視野)的疊圖影像，並使用紅色和綠色圓圈標記已識別的物體(Objects)。紅色圓圈表示死細胞，綠色圓圈表示活細胞。

結論
SF9 細胞存活率評估最建議的染劑選擇是 FDA/PI，因為它具有一致的表現(Performance)和相容性(Compatibility)。當 FDA/PI 與 SF9 細胞一起使用時，LED 等級參數需要調整為 GF 1 / RF 7，因為 FDA 可以產生高訊號，而 PI 訊號與應用於哺乳動物細胞時相比可能較低。不建議對貼附培養的 SF9 繼代培養進行 TB 染色，儘管在懸浮培養時這個問題可能會得到緩解。此外，增加 LED 曝光等級可能會解決一部份 AO/PI 染色 SF9 細胞後， AO 產生低訊號的問題。然而，這種方法可能會影響 LUNA-FX7™ 自動細胞計數器的整體表現。綜合以上，選擇合適的染劑和調整LUNA-FX7™ 自動細胞計數器的最佳 Exposure level 參數，可以為監測 SF9 細胞品質提供一種很好的方法。

原廠文章
Automated cell counting and viability measurement of Insect cells (SF9): Comparison of staining method