2024/07/12 α-Synuclein胜肽抑制劑可預防帕金森氏症相關纖維化和細胞毒性
帕金森氏症(Parkinson’s disease, PD)主要病理特徵會在腦中出現具有細胞毒性路易體(Lewy bodies)其是否存在α-突觸核蛋白(α-Synuclein, αS)於澱粉樣蛋白纖維(amyloid fibrils)中。由低溫電子顯微鏡(cryo-EM)分析得知αS為14 kDa蛋白質由三個不同區域構成，分別由residues 61–95中心由非類澱粉蛋白成分(central nonamyloidogenic component, NAC)構成、residues 1~60構成N端區域(N-terminal region, NTR)及residues 96–140構成C端區域(C-terminal region, CTR)。αS的NAC區域大多數為疏水性，容易發生以αS作為聚集種子模板(aggregation seed template)的纖維化。此外，近期的研究指出於NTR區域特定序列motif存在，對於澱粉樣蛋白纖維化形成扮演著重要角色。於本篇實驗中設計4種異構體胜肽(isomeric peptides)作為預防αS聚集可能性抑制劑。這些胜肽是基於αS的NAC及NTR片段發現的序列分別為, NAC-TP-L, NAC-TP-D, NTR-TP-L及NTR-TP-D。其胺基酸序列分別為GVLYVGS-Aib(NTR-TP-L), gvlyvgs-Aib (NTR-TP-D), VAQKTV-Aib (NACTP-L)及 vaqktv-Aib (NAC-TP-D)。他們設計的目的是為了識別並融入不斷增生αS的β-sheet結構，以C端的α-aminobutyric acid (Aib)residues作為中斷β-strand生成的斷路器(breaker)。
檢驗原理
αS延長分析(αS elongation assay)及初成核分析(primary nucleation assay)為兩項成熟的螢光分析技術。兩種方法都是透過偵測硫磺素T(Thioflavin T, ThT)螢光增加來進行，純化過的野生型αS(WT αS)會在搖晃一段時間慢速聚集， ThT可從緩衝溶液中摻雜入不斷增生的αS的β-strand結構中導致螢光增加，因此β-strand與螢光之間存在具有直接相關性。在αS延長分析中反應開始時微量的種子纖維(seed fibrils)加入WT αS中。相較於初成核分析144小時，αS延長分析減少了24小時。
圖一、αS會緩慢聚集形成寡聚物(Oligomer)最終形成澱粉樣蛋白纖維(amyloid fibrils)，同時加入硫磺素T(ThT)。
材料方法
● 384孔微量孔盤(black polystyrene, Greiner)
● 硫磺素T(Sigma-Aldrich)
● 單體(Monomeric)αS (wild-type, WT)
● NAC and NTR, L & D胜肽抑制劑
● 全自動濾鏡式盤式分析儀Omega series plate reader (BMG LABTECH)
實驗流程
單體WT αS依照先前文獻的方法表現並純化，胜肽抑制劑經由Fmoc固相態化學合成法進行製成。用於延長分析的種子纖維透過加熱及攪拌單體αS(50 μM in PBS, pH 7.4)於45 °C下進行24小時，隨後以超音波震盪處理。透過延長分析中及初成核分析評估NAC及NTR胜肽對於αS纖維的形成。在37°C條件下使用ThT(20 μM) 偵測αS纖維延長24小時的變化。胜肽抑制劑分別以1:1或1:5的莫爾數比例加至帶有5%(w/w)αS種子纖維的單體αS（PBS 中 50 μM，pH 7.4）。初級成核分析中αS纖維形成也使用ThT(20 μM)，在37°C下偵測144小時。胜肽抑制劑依分別以5:1、1:1、1:5莫爾濃度比例添加於單體αS（PBS中100μM，pH 7.4）。所有分析至少進行三重複測試，這些數據皆以平均值±標準差(mean±SEM)獨立分析。
儀器設定
結果與討論
於延長分析中結果顯示，WT αS在4小後即達到平台期，表示在這個時間點即形成熟的纖維(mature fibril)。在莫爾比例為1:1的情況下，NAC-TP-L及NAC-TP-D的異構體(圖二，紫色及綠色曲線)，並沒有降低αS的生成以及減少纖維延長率(rate of fibril elongation)。然而在NTR-TPs當中均顯著減少纖維的生成， NTR-TP-L抑制47%; NTR-TP-D抑制31%。以延長率(rate of elongation)NTR-TP-L降低8倍，NTR-TP-D降低9倍(圖二，玫瑰色及黃色曲線)。有趣的是在αS:胜肽抑制劑中1:5莫爾比，NTR-TP-DαS纖維生成率大幅度減少51%(圖二，綠色曲線)，NTR-TP-L在此比例下，對於纖維生成及延長率並無影響。值得注意的是兩者(NTR-TP-L及NTR-TP-D)均能有效預防纖維化延長率減少15倍及形成率抑制98%。
圖 2: αS 延長分析(elongation kinetic assays)。分別為不使用抑制劑(灰色)及使用抑制劑組別。NTR-TP-L（玫瑰色）、NTR-TP-D（黃色）、NAC-TP-L（紫色）和NAC-TP-D（綠色）。纖維延長的速率是透過動力學曲線接近t=0的初始速度（斜率）來判定。
圖三、(A)於1: 5比例下αS:抑制劑初成核分析動力學曲線。WT αS(灰色), NAC-TP-L(紫色), NAC-TP-D(綠色), NTR-TP-L(玫瑰色), NTR-TP-D(黃色)。(B)延滯時間(Lag times)於不同莫爾濃度αS:抑制劑比例1:5、1:1及5:1。
結論
總而言之，我們篩選出來NAC-TPs及NTR-TPs都能降低成核速率並防止纖維延長，從而減少αS纖維產量。細胞活力分析(Cell viability)研究指出，NAC-TPs和NTR-TPs顯著降低了αS聚集對於Neuro-2a和Caco-2細胞的細胞毒性。總體而言，本研究為帕金森氏症（PD）治療藥物候選者設計和開發奠定了基礎。這項實驗長達167小時的震盪分析實驗，也顯示BMG盤式分析儀具有極佳的適應性，用於硫磺素T聚集分析。Optima為BMG舊款機型(本研究中使用的機器已有15年以上的歷史，仍然夠強壯可運行此實驗)，目前已由Omega全自動濾鏡式盤式分析儀取代。Omega配備了重型振盪機構、加熱裝置和軟體，輕鬆的演算法設定使ThT聚集分析變得更加簡單。
原廠文章: Jovcevski et al. Peptidic inhibitors of α-Synuclein preventing Parkinson’s disease-associated fibrilization and cytotoxicity (2024).
檢驗原理
αS延長分析(αS elongation assay)及初成核分析(primary nucleation assay)為兩項成熟的螢光分析技術。兩種方法都是透過偵測硫磺素T(Thioflavin T, ThT)螢光增加來進行，純化過的野生型αS(WT αS)會在搖晃一段時間慢速聚集， ThT可從緩衝溶液中摻雜入不斷增生的αS的β-strand結構中導致螢光增加，因此β-strand與螢光之間存在具有直接相關性。在αS延長分析中反應開始時微量的種子纖維(seed fibrils)加入WT αS中。相較於初成核分析144小時，αS延長分析減少了24小時。
圖一、αS會緩慢聚集形成寡聚物(Oligomer)最終形成澱粉樣蛋白纖維(amyloid fibrils)，同時加入硫磺素T(ThT)。
材料方法
● 384孔微量孔盤(black polystyrene, Greiner)
● 硫磺素T(Sigma-Aldrich)
● 單體(Monomeric)αS (wild-type, WT)
● NAC and NTR, L & D胜肽抑制劑
● 全自動濾鏡式盤式分析儀Omega series plate reader (BMG LABTECH)
實驗流程
單體WT αS依照先前文獻的方法表現並純化，胜肽抑制劑經由Fmoc固相態化學合成法進行製成。用於延長分析的種子纖維透過加熱及攪拌單體αS(50 μM in PBS, pH 7.4)於45 °C下進行24小時，隨後以超音波震盪處理。透過延長分析中及初成核分析評估NAC及NTR胜肽對於αS纖維的形成。在37°C條件下使用ThT(20 μM) 偵測αS纖維延長24小時的變化。胜肽抑制劑分別以1:1或1:5的莫爾數比例加至帶有5%(w/w)αS種子纖維的單體αS（PBS 中 50 μM，pH 7.4）。初級成核分析中αS纖維形成也使用ThT(20 μM)，在37°C下偵測144小時。胜肽抑制劑依分別以5:1、1:1、1:5莫爾濃度比例添加於單體αS（PBS中100μM，pH 7.4）。所有分析至少進行三重複測試，這些數據皆以平均值±標準差(mean±SEM)獨立分析。
儀器設定
結果與討論
於延長分析中結果顯示，WT αS在4小後即達到平台期，表示在這個時間點即形成熟的纖維(mature fibril)。在莫爾比例為1:1的情況下，NAC-TP-L及NAC-TP-D的異構體(圖二，紫色及綠色曲線)，並沒有降低αS的生成以及減少纖維延長率(rate of fibril elongation)。然而在NTR-TPs當中均顯著減少纖維的生成， NTR-TP-L抑制47%; NTR-TP-D抑制31%。以延長率(rate of elongation)NTR-TP-L降低8倍，NTR-TP-D降低9倍(圖二，玫瑰色及黃色曲線)。有趣的是在αS:胜肽抑制劑中1:5莫爾比，NTR-TP-DαS纖維生成率大幅度減少51%(圖二，綠色曲線)，NTR-TP-L在此比例下，對於纖維生成及延長率並無影響。值得注意的是兩者(NTR-TP-L及NTR-TP-D)均能有效預防纖維化延長率減少15倍及形成率抑制98%。
圖 2: αS 延長分析(elongation kinetic assays)。分別為不使用抑制劑(灰色)及使用抑制劑組別。NTR-TP-L（玫瑰色）、NTR-TP-D（黃色）、NAC-TP-L（紫色）和NAC-TP-D（綠色）。纖維延長的速率是透過動力學曲線接近t=0的初始速度（斜率）來判定。
初成核分析分別1:1、1:5及5:1的比例αS：抑制劑混合物進行實驗。不添加抑制劑的情況下，αS表現類似於S型函數聚集動力學曲線(aggregation kinetics)，其中延滯期(lag-phase)持續28小時，在52小時之後顯著的纖維延長被觀察到，並於115小時候達到平原期(plateau)(圖三A、灰色曲線)。在所有莫爾濃度比例下NAC-TPs及NTR-TPs皆表現類似於S型函數聚集動力學曲線(圖三僅顯示1:5莫爾濃度)。綜合上述我們觀察到隨著NAC-TPs和NTR-TPs濃度增加總纖維產量(total fibril yield)會有所減少(數據未顯示)。此外，除了1:1莫爾數比的NAC-TPs(包含NAC-TP-L及NAC-TP-D)之外，在所有莫爾濃度比的NAC-TPs及NTR-TPs延滯期皆延長了。而在1:1莫爾濃度比的NAC-TPs相對單獨αS組別延滯期減少了一些時間(圖三、B)。
圖三、(A)於1: 5比例下αS:抑制劑初成核分析動力學曲線。WT αS(灰色), NAC-TP-L(紫色), NAC-TP-D(綠色), NTR-TP-L(玫瑰色), NTR-TP-D(黃色)。(B)延滯時間(Lag times)於不同莫爾濃度αS:抑制劑比例1:5、1:1及5:1。
結論
總而言之，我們篩選出來NAC-TPs及NTR-TPs都能降低成核速率並防止纖維延長，從而減少αS纖維產量。細胞活力分析(Cell viability)研究指出，NAC-TPs和NTR-TPs顯著降低了αS聚集對於Neuro-2a和Caco-2細胞的細胞毒性。總體而言，本研究為帕金森氏症（PD）治療藥物候選者設計和開發奠定了基礎。這項實驗長達167小時的震盪分析實驗，也顯示BMG盤式分析儀具有極佳的適應性，用於硫磺素T聚集分析。Optima為BMG舊款機型(本研究中使用的機器已有15年以上的歷史，仍然夠強壯可運行此實驗)，目前已由Omega全自動濾鏡式盤式分析儀取代。Omega配備了重型振盪機構、加熱裝置和軟體，輕鬆的演算法設定使ThT聚集分析變得更加簡單。
原廠文章: Jovcevski et al. Peptidic inhibitors of α-Synuclein preventing Parkinson’s disease-associated fibrilization and cytotoxicity (2024).
