新知應用小學堂

2024/08
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2024/08/19 微觀世界的萬花筒-螢光顯微鏡

螢光顯微鏡是現代生物醫學研究中不可或缺的工具。(圖一) 由於其高靈敏度和高分辨率，螢光顯微鏡常用於細胞生物學、分子生物學等領域。本文將介紹螢光顯微鏡的基本原理、使用時機及其應用等。


(圖一, Bestscope BS-7000系列螢光顯微鏡)

螢光顯微鏡的主要優勢在於其能夠觀察到細胞或組織中特定分子的螢光訊號，這使得它能提供比傳統光學顯微鏡更詳細的資訊。這種顯微鏡特別適合用於分子定位、動態觀察和多重標記。例如，通過螢光顯微鏡，研究人員可以精確地了解特定的分子在細胞內的位置、觀察細胞過程中的變化、或同時標記多種分子進行多重觀察。(圖二)



(圖二, 免疫螢光染色Immunofluorescence assay。HeLa 細胞培養並以肌動蛋白抗體 (綠色)、vimentin (紅色)和 DNA (藍色)染色。Immunofluorescence Test， In subject area: Nursing and Health Professions from: Atlas of Sexually Transmitted Diseases and AIDS (Fourth Edition), 2010 )

螢光顯微鏡的原理為螢光染劑在特定波長的激發光照射下發出螢光的特性。(圖三)樣本中的特定分子會和螢光染劑結合，當使用螢光顯微鏡時，顯微鏡使用特定波長的光源(如汞燈或LED燈）激發樣品中與特定分子結合的螢光染劑。染劑在吸收了激發光的能量後，會發出特定波長的螢光。顯微鏡通常配備了光學過濾系統，例如濾光片。這些濾光片能夠選擇性地阻擋非特定波長光源，只允許特定波長範圍光訊號通過，最終進行成像。



(圖三，不同波長所發出的光)

螢光顯微鏡在各領域中有著廣泛的應用。它在細胞生物學中，能夠觀察細胞內結構及細胞分裂過程，常用技術包含活細胞成像(Live-Cell Imaging)和螢光漂白恢復(FRAP，Fluorescence Recovery After Photobleaching)。在分子生物學中，螢光顯微鏡用於研究基因表現、蛋白質相互作用等，相關應用有螢光共振能量轉移FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)和螢光原位雜交(FISH, Fluorescence In Situ Hybridization)。而在醫學和科學領域，包含癌症或疾病等方面研究中，相關應用有使用螢光顯微鏡進行免疫螢光染色(Immunofluorescence Staining)了解特定蛋白質的表現和分布，和使用多光子顯微鏡(Multiphoton Microscopy)了解皮膚藥物傳遞之機制、觀測肝硬化的現象。

儘管螢光顯微鏡具有諸多優勢，但仍面臨一些限制。例如，螢光染劑在長時間曝光下會逐漸失去螢光，這種現象被稱為光漂白。此外，非特異性螢光和背景訊號也可能干擾觀察結果。而且高性能的螢光顯微鏡價格昂貴，對實驗室的資金要求較高，未來的發展方向可能會在這些限制方面帶來改善。例如，新型高效螢光染劑和激發光源的開發將有助於提高顯微鏡的性能或結合其他成像技術，如超高解析度成像，進一步提高觀察的細節。隨著技術的普及和設備製造工藝的改進，螢光顯微鏡的成本有望逐漸降低，讓更多實驗室能夠使用這一工具。

螢光顯微鏡作為一種強大的成像工具，將繼續推動生物醫學領域的研究和應用，為科學家們提供更加深入的觀察手段。未來的技術進步將使我們能夠更好地探索生命的奧秘。

2024/08/28 細胞外囊泡製劑製造與管制之研發策略指導原則

千呼萬喚始出來

113年5月17日，財團法人醫藥品查驗中心(CDE)發佈了“細胞外囊泡製劑製造與管制之研發策略指導原則_第一版”，該指導原則分為適用範圍、製造與管制考量、參考文獻三大部分。內容定義了何謂細胞外囊泡製劑及其適用範圍，並描述了以申請臨床試驗為目的之建議分析項目與檢測標準。以下為岑祥技術部依據指導原則內容所整理的摘要表格，供參：


圖一、摘要：細胞外囊泡製劑製造與管制之研發策略指導原則。圖中標示數字為指導原則對應章節。
 

裡面說了什麼？

用於生產的細胞
細胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs，或稱胞外體)的相關研究與產業應用在近年蓬勃發展，而更廣為人知的則是EV的其中一種類別：Exosome(外泌體)。EV和Exosome在很多情境下會被混用，或是由於偵測方式、實驗原理的限制，在研究或應用上，有時並沒有被界定清楚。
而在「細胞外囊泡製劑製造與管制之研發策略指導原則」(以下簡稱「本指導原則」)中的第一個重點，即給出了「細胞外囊泡製劑」(以下簡稱「EV製劑」)的定義與適用範圍：須是人源活細胞分泌出來的、具備雙層脂質膜(Lipid bilayer)結構，並且經過分離與純化的囊泡才屬於適用範圍。也就是說，沒有經過分離和純化的培養液樣品、不是人源細胞分泌的EV (例如植物、動物細胞來源的EV)、不是細胞分泌出來的分泌物(例如是將細胞震破而得的囊泡)、以及細胞分泌出來的蛋白質(不具有脂雙層結構)等，上述細胞產物或囊泡，皆不適用此原則。值得注意的是，適用範圍中還提到了使用EV作為載體搭載藥物的部分，若是作為藥物載體的EV部分亦具有療效，則同樣適用；反之，若是EV部分不具有療效，則不適用此原則。
由於EV是由細胞分泌出來的產物，即EV製劑的起始物是細胞本身，因此在原物料管控部分，起始物細胞也是審查的一大重點。起始物指的是用於生產EV的自體或同種異體之組織或細胞，由於會有不同細胞提供者(不同人)，或是同一提供者但不同次提供細胞(同一人、不同次)的差異，為了維持製造品質一致性，因此需要建立細胞庫系統。需要特別注意的是，由於病毒的大小(通常為10-300nm)可能與EV類似，且在製程中較難去除、去活化，故若起始物細胞有病毒感染，則在後續分離、純化EV的過程中，病毒很可能會一併被濃縮，進而造成人體危害，因此需參照ICH Q5A進行病毒安全性檢測。此外，到達LIVAC (Limit of in vitro cell age, 最長體外培養細胞年齡)的生產細胞，也需進行特性分析與病毒相關試驗，以確認整個生產培養期間均維持所要求的細胞特性。
 
生產過程中使用到的原物料
在生產細胞培養的過程中，可能會使用到生物性來源原料，這部分可參考「製程中使用生物性原料之研發策略指導原則」，且須包含外來病原安全性之評估資料。
而中心特別強調的是，在細胞培養過程中，經常使用到血清(Fetal Bovine Serum, FBS)或是血小板裂解液(Human Platelet Lysate, hPL)，可能的話請避免使用此種添加物，主要原因之一是FBS或hPL本身就含有細胞外囊泡，可能造成生產出來的EV製劑中，大部分其實是FBS或hPL這些培養添加物中的EV，而非細胞本身生產出來的EV，進而影響EV製劑的品質特性。
然而，為了支持細胞在體外培養過程中的營養環境與生長所需，FBS或hPL往往是培養過程中的必須添加物；改用無血清培養系統或許是一個選項，但仍會因此衍伸出影響細胞生長、細胞特性改變與EV產率等議題。
 
~深入了解：關於Exosome生產時，血清與細胞培養系統的議題與選用~




如果難以避免，如何有效解決？
既然FBS或hPL常是培養過程中的必須添加物，因此若無法避免使用該原物料時，中心則建議在特性分析(如數量、鑑別、純度、效價等)時，納入模擬細胞外囊泡(Mock extracellular vesicle)對照組(以下簡稱「Mock EV」)。Mock EV指的是包含該試劑，但未進行細胞培養的分離、純化。舉例來說，若生產過程中使用到hPL，則可將hPL本身拿去進行分離、純化，作為Mock EV對照組，再與EV製劑組別比較，進行特性分析。
 

圖二、AventaCell Exosome-Depleted UltraGRO™-PURE GI的奈米顆粒高去除率(Depletion rate: 奈米顆粒去除的程度) 

圖二是AventaCell艾瑞生醫生產的Exosome-Depleted UltraGRO™-PURE GI (ED UGP GI)產品之NTA (Nanoparticle Tracking Analysis, 奈米粒子追蹤技術)數據。AventaCell的ED UGP GI產品，是以UltraGRO™-PURE GI(UGP GI)為基底，確保已去除95%以上奈米粒子的商業化Exosome-depleted hPL產品。由圖二NTA數據可知，Depleted hPL組別與Non-depleted hPL組別相比，每mL的particle含量已由10^11下降到10^9等級，接近Basal media的程度(alpha-MEM media alone組別)，且5次實驗結果的Depletion rate平均達99.07%。Depletion rate ≈ 99%也是一般實驗室自行去除血清添加物中EV的基準。製程中血清添加物EV的去除，可確保收集到的囊泡產物，是來源自目標細胞(Cell-derived EV)，而非來自血清添加物(Serum-derived EV)干擾，進而確保EV製劑的效價、純度等特性。
此外，指導原則中特別強調了EV製劑的病毒檢測，包含原物料(2.1.1 起始物與2.1.2 其他原料、試劑與賦形劑)以及製劑品管(2.4 品質控管之2.4.7外源性病毒檢測)兩部分都有提及，顯示監管單位相當重視EV製劑的外來病原體安全性評估。
ED UGP GI是由UGP GI為基底製成，因此保留了UGP GI的各個特色，包含無異種來源(Xeno-free)特性，同樣也是病毒減活型(Viral inactivated)產品：UGP GI經過伽瑪輻射線(Gamma Irradiation, GI)之病原體減活處理(Pathogen reduction treatment, PRT)，並依據ICH/EMA guidelines，使用四種模式病毒(BVDV, Reo3, HSV1, MMV)驗證其GI效力，確保達到4 log10(一萬倍)以上病毒減活效果(Ref：AventaCell ISCT Gamma Poster)，加上具有美國FDA DMF、日本PMDA、歐盟EP 5.2.12.4 Compliance，因此UGP GI搭配ED UGP GI，作為EV製劑培養生產細胞之原物料，是目前市場上，既能符合多重監管需求、優化製程，並降低成本與使用者負擔的hPL產品。
 
小結

本篇目前只討論了生產細胞培養、原物料部分，但實際上指導原則中還描述了包含製備/分離/純化、特性分析、品管、安定性檢測等原則，供研究人員參照。這部分，亦可參考MISEV2023的更新內容。誠如中心在觀點分享講座中所述，EV研究與產業發展快速，因此本指導原則主要是針對科學性想法與各方先進之經驗提出實驗建議，並非訂下法規規定，故未來可能會再修改，與時俱進。
期待下次再與大家分享EV研究與產業應用更新的時刻。
 

參考資料


1.細胞外囊泡製劑製造與管制之研發策略指導原則_第一版，中華民國113年05月17日(財團法人醫藥品查驗中心)


2.113年創新生物藥開發與先進技術製造法規指導原則制訂觀點分享 (財團法人醫藥品查驗中心113.3.20)


3.2024年度創新生物藥開發與先進技術製造法規指導原則 制訂觀點分享(1)(含影片與簡報)(CDE)


4.Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 2024 Feb;13(2):e12404. doi: 10.1002/jev2.12404.


5.韓國食品藥物安全評估研究所發布《細胞外囊泡製劑品質、非臨床及臨床評估》指引 (環球生技月刊2023-10-24))


6.ICH Q5A「人類或動物細胞株衍生之生物技術產品的病毒安全性評估」指引草案 (當代醫藥法規月刊147期)


7.ICH Q5D：生物技術/生物製劑所需生產用細胞受質之取得與特性分析指引(衛生福利部食品藥物管理署中華民國 111 年 11 月)


8.製程中使用生物性原料之研發策略指導原則(CDE)

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