2022/10

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微生物在很多領域上都有被使用的機會，如測試抗生素耐藥性、環境對菌種生長的影響、微生物工業生產或合成生物學等，而以上種種的應用都會以微生物生長曲線作為其中探討的方向。
吸光值OD₆₀₀測量是探討微生物生長曲線最常見方法，但在研究多菌株相互作用時，使用OD₆₀₀測量微生物生長曲線具有嚴重的局限性，因為OD₆₀₀不可能測量混合培養物中單個菌株的生長。
隨著科技的進步與發展，越來越多研究開始使用微孔盤判讀儀來進行細菌生長曲線的探討。由於微孔盤判讀儀除了可進行吸收光外，還可以螢光和冷光的同步檢測。此外，還可進行高通量即時自動監測篩選，使微孔盤判讀儀成為進行微生物生長曲線檢測的趨勢之一。
在2021發表在Applied and environmental microbiology 的文章，作者為了建立可以評估細菌混合培養的生長情況的平台，利用了螢光重組蛋白菌進行追踪於不同液體培養基中單個菌株的生長。
首先要了解細菌生長利用吸光值OD₆₀₀與螢光強度兩方式是否有相關性，作者是利用了微孔盤判讀儀(Fluostar Omega,BMG Labtech)同時進行吸收光OD₆₀₀和螢光強度測量標記了紅色螢光蛋白的泛菌( Pantoea eucalypti )(Pe::red)在不同濃度培養液的生長狀況。結果可得出，細菌菌株螢光強度曲線的 AUC 與每種液體培養物的最終OD₆₀₀ 之間存在統計學上顯著的正相關關係(圖１)。

圖１：Pe::red 在不同濃度培養液的生長曲線

接著，作者為了確定兩個菌株共同培養對的菌株生長的影響，把標記了紅色螢光蛋白的泛菌( Pantoea eucalypti )(Pe::red)與標記了黃色螢光蛋白的鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)( Sp::yellow)進行共同培養並同時檢測兩種螢光強度作追蹤。結果可得出Pe::red 和 Sp::yellow 共同培養時，Sp::yellow的生長會受到 Pe::red 的強烈影響(圖２) 。

圖２：Pe::red 和 Sp::yellow的競爭生長狀況

綜合得出利用螢光重組蛋白菌株可以同時以高時間分辨率和高通量方式測量幾種細菌菌株的生長情況。這為日後研究細菌相互競爭和促進作用建立了很重要的檢測平台。

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細菌計數，限制多多
 
在環境監測、食品安全、衛生保健、學術研究等許多應用領域中都有細菌計數需求，但傳統微生物計數的方法卻存在許多偵測限制，甚至影響計數結果。
 
最廣泛使用的塗盤、計算菌落形成單位(Colony forming unit, CFU)的方法，需要將樣品稀釋，經隔夜培養後，才能計算生長出來的菌落，不但需要隔夜培養的這段時間，無法得知樣品當下的細菌含量，後續也需要透過人工方式一顆一顆計算菌落，除了耗時耗力，也因為生長菌落有大有小，因此每個實驗者計數出來的結果可能都不一樣，加上若是遇到細菌的VBNC (Viable But Non-Culturable)狀態，在細菌存活卻無法培養的狀態下，甚至很可能會影響結果的判讀。
 
舉例來說，VBNC是大腸桿菌在遭遇環境壓力時的一種生理表現，此時大腸桿菌會維持基本代謝能力，卻無法透過塗盤培養，一旦環境壓力消失，大腸桿菌就會恢復到正常生長的狀態；因此若是在水質檢測時，以可培養的大腸桿菌數當作標準，很可能就會因為大腸桿菌處於VBNC狀態而誤判水質安全的程度。
 
另一個常見的細菌計數方法則是濁度法，即透過測OD600吸光值去回推細菌數量，這種方法會需要搭配樣品序列稀釋並塗盤算菌落的結果，作為吸光值的標準品以對照實際菌數，同樣會有精準度不足的問題，且該方法只能計算總菌數，並無法排除死菌數的影響。其他如ATP測定法、電阻抗法等透過代謝分析去回推菌數的方法，也會有同樣需要搭配標準品、相對不精準的缺點。
 
流式細胞術(Flow cytometry)則是目前常見方法中能獲得較精準菌數的方式，Flow也能夠計算活菌數與總菌數，但使用Flow計數細菌需要貴儀、合適抗體、試劑，使用成本相對較高，且對實驗者的操作要求也較高，並非每個實驗者都能輕易上手；另外，大多數細菌會形成chains或cluster等團塊，在Flow分析時，一隻細菌和一千隻細菌形成的團塊，都可能被當作single event而被計算成一隻細菌，進而影響計數結果。
 
儘管傳統方法都各有限制，但計算細菌含量仍是各應用領域中很重要的一個步驟，那麼還有什麼方法可以改善傳統細菌計數耗時耗力、結果不精準的缺點呢？
 
以影像分析精準計算細菌數量──QUANTOM Tx™ 微生物細胞計數器


 
影像分析，眼見為憑
韓國廠牌Logos Biosystems的QUANTOM Tx™微生物細胞計數器，是一台以影像分析的方式計算微生物數量的自動微生物細胞計數器，可直接在觸控螢幕上看見要計數的細菌分佈，計數後也可透過Tag功能，確認機器判定的細菌細胞。
 
計算快速，結果精準
內建電腦，具備細菌專用的演算法，可透過各種參數分析不同型態細菌，另有獨特De-clustering參數功能，即使是形成chain或cluster的細菌樣品，也可最大程度解析並計算出單顆細菌，並且具備自動對焦功能，由機器自動計數，一鍵即可快速獲得精準菌數結果。
 
機器判定，避免人為誤差
Protocol功能頁面可依據不同細菌種類自由設定參數條件，即使是不同實驗人員也可使用同樣實驗條件，獲得一致計數結果，避免人為判斷差異及計算誤差導致的結果謬誤。
 
活菌數、總菌數皆可計算
配備細菌專用拋棄式玻片，以及活菌數、總菌數兩種螢光染劑kit，改良染劑不論格蘭氏陽性/陰性菌、VBNC狀態、難染色細菌等皆適用，可根據實驗需求挑選，不用額外尋找相應試劑耗材。
 
操作簡易好上手，分鐘內獲得結果


使用流程為染色→離心→一鍵計數，通常情況下最快30分鐘內即可獲得計數結果，染色時間可依菌種不同做調整，不但操作簡單，實驗者學習容易，更可節省隔夜培養時間，計算當下樣品菌數，當天即可獲得菌數結果，且可輸出固定格式報告，輕鬆管理實驗結果。
 
已測試過多種菌種計數
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QUANTOM Tx™, Results In Minutes.
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