2021/11/10 LAMP 搭配BMG LABTECH Reader進行SARS-CoV-2 初步檢測
COVID-19疫情全球性爆發，除了研發新型冠狀病毒(SARS-COV-2)抗病毒藥物及疫苗，在短時間內篩檢出受感染的患者或無症狀感染者對於疫情控管來說更加重要，因此，國際社會努力創建和擴展可用的檢試方法。最近新型體外核酸擴增技術，逆轉錄環介導的等溫擴增（RT-LAMP)，有望提供了一種快速診斷方法。
恆溫環狀擴增法（Loop-Mediated Isothermal Amplification;LAMP）為一恆溫、具環狀形式的擴增法。RT-LAMP檢測通過識別幾個不同的序列目標RNA以高選擇性對其進行擴增，使其靈敏度和特異性相當於傳統PCR方法。有別於傳統PCR所使用的Taq 聚合酶，LAMP檢測使用 Bst 聚合酶。而這聚合酶在65 °C具高DNA strand置換能力，因此LAMP 檢測可在 65 °C恆溫條件下進行。由於減少了一系列溫度循環所，檢測時間減少到大約30-60分鐘。
反應終止後，由於在 LAMP 檢測中，Bst 聚合酶和三對primers識別目標核酸序列的不同位置，當目標核酸被放大後會釋放氫離子，因此可以利用magnesium pyrophosphate沈澱的方式，或利用SYBR Green螢光顯色來判定結果。除此之外，由於在 LAMP 檢測會使pH值改變，因此還可利用pH-sensitive dye產生之顏色改變，透過microplate reader進行檢測。[圖1]
圖1：逆轉錄環介導的等溫擴增（RT-LAMP)測定原理
FLUOstar Omega 預熱至 65 °C 2.5 小時然後使用以下設定進行LAMP檢測[表1]：
表1：LAMP檢測設定方法
當目標核酸被放大後會釋放氫離子，樣品會由粉紅色到黃色，因此隨時間發生顯著變化，560 nm 處的明顯吸收峰減弱，而 420 nm 處出現一個小吸收峰.。因此利用OD415 nm 和 OD560 nm 之間的差異 (ΔOD) 來分析時間內pH-sensitive dye之顏色變化 。
在 LAMP 檢測開始後， positive control的ΔOD觀察到有顯著增加在約 18 分鐘。雖然negative control的ΔOD 也出現增加，但是在更晚的時間，這是因為negative control非特異性假擴增而導致的。[圖2]
在 LAMP 檢測開始後， positive control的ΔOD觀察到有顯著增加在約 18 分鐘。雖然negative control的ΔOD 也出現增加，但是在更晚的時間，這是因為negative control非特異性假擴增而導致的。[圖2]
圖2： SARS-CoV-2 LAMP 60分鐘動力學測量，數據為∆OD (415 nm-560 nm)，測量範圍標記為橙色，n=4.
根據ΔOD的時間的變化來作判斷結果外，也可以使用BMG LABTECH提供的分析軟件-MARS計算positive control曲線和negative control曲線分別達到最大斜率的時間(time-to-maximum-slope)找出最佳反應及判斷時間。Positive control大約 19 分鐘後達到最大斜率，而 negative control需要大約 39 分鐘才達到最大斜率 [圖3]，表示negative control在39 分鐘開始出現非特異性假擴增，因此在比較Positive control與negative control的數據時需使用的範圍為反應開始後19-39 分鐘。
圖3：Positive control曲線和Negative control曲線達到最大斜率的時間(time-to-maximum-slope)。n=4, p<0.001.
RT-LAMP 檢測配搭BMG LABTECH 的 Omega 系列可作為一種快速診斷方法並提供了一個機會，可以在高通量下工作，提高診斷能力，因此非常適合進行即時檢測，如適用於移動檢測中心、急診科、住宅和機場等地方進行快篩。
原廠文章連結：Ann-Cathrin Volz et al. LAMP assay for detecting SARS-CoV-2 RNA using an absorbance-based colorimetric readout(2021) https://reurl.cc/GbXqjy
原廠文章連結：Ann-Cathrin Volz et al. LAMP assay for detecting SARS-CoV-2 RNA using an absorbance-based colorimetric readout(2021) https://reurl.cc/GbXqjy
