2021/06

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目前已有三千多項關於病毒載體正在進行臨床試驗，其中約10%是以慢病毒載體進行的。慢病毒載體通常是透過多種質體載體瞬時轉染到HEK293T細胞而產生的，病毒會釋放到上清液中，因此要將細胞培養液中的細胞/雜質移除，而在CAR-T研究中則是缺乏建立LV澄清的黃金方法。常規標準使用以離心機分離再進行上清液微孔濾膜澄清，但是僅透過單一步驟的過濾再加上DE助濾劑的輔助，將可有效捕獲和澄清LV，且提高LV純化和T細胞轉導效率。
實驗目的和總結:   主要使用含有矽藻土(DE)之Sartoclear Dynamics^® Lab V50來澄清懸浮細胞HEK293產生的慢病毒載體(Lentiviral vectors, LV)，透過使用實驗設計(DOE)分析Sartoclear Dynamics^®Lab V50和與標準法比較，結果發現:
1. 高濃度DE雖降低感染力價，但有利降低濁度和加快過濾時間。 2. 較低濃度DE有利回收高LV力價。 3. 與標準法比，Sartoclear Dynamics^®Lab V50可更好的將濁度/汙染物降低、提升過濾能力和提升整體膜的使用容量。 4. 相比標準法，更快、更安全進行處理，且減少耗材使用量。 5.  Sartoclear Dynamics^®Lab V50適用於捕獲和澄清慢病毒載體。  
實驗結果: 一、使用MODDE^® software (Sartorius)在DOE研究中評估DE濃度和接觸時間對濁度、感染力價和過濾時間的影響: 1. 當DE濃度升高，感染力價呈線性下將。 2. 隨著DE濃度的增加，過濾時間減少。 3. 隨著樣品與DE的接觸時間越長，濁度線性降低。
  二、評估Sartoclear Dynamics^®Lab V50對處理時間的影響: 1. 使用標準法，大約25ml後，第一個Sartolab^®RF50過濾器堵塞，因此需使用第二個Sartolab^®RF50將剩餘液體過濾，費時費力。 2. 使用Sartoclear Dynamics^®Lab V50因不需再進行離心，可有效降低總處理時間3.8倍。
  三、評估Sartoclear Dynamics^®Lab V50對濁度和過濾器容量的影響: 1. 標準法:濁度可至43NTU (89 %降低)。 2. 使用Sartoclear Dynamics^® Lab V50 (5g/L DE)，可將濁度降到21NTU(95%降低)。 3. 搭配最少量5g/L之DE，來確認澄清過濾器的容量，直到過濾阻塞為止，發現Sartoclear Dynamics^®Lab V50 可裝置超過50ml的容量，標準僅約過濾33ml時發生阻塞。  
四、評估Sartoclear Dynamics^®Lab V50去除雜質的影響: 1. 約10 g/L的DE會增加蛋白質和dsDNA的移除。 2. 10 g/L~40 g/L之間的較高DE濃度，移除能力沒有明顯增加。 3. 與常規離心後，再澄清方法相比，不論DE濃度為何皆顯著提高雜質移除濾。  
★最後跟大家複習如何操作Sartoclear吧! 將矽藻土倒入細胞培養液中進行均勻混合→將過濾裝置與真空馬達相連接→將含有矽藻土之細胞培養液倒入過濾裝置→真空過濾→過濾即完成。  
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Fig. 2 Antibody array images 左為化學冷光偵測的 membrane-based array；右為螢光偵測的glass slide-based array