新知應用小學堂

2023/02
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2023/02/09 核酸定量之方法比較

核酸包含了人類生命的所有信息。自從過去幾十年被發現以來，從低通量到高通量的各種方法都依賴於準確核酸量的應用，因此核酸定量方法的選擇便非常重要。核酸定量方法主要可分為UV-Vis吸光值測量和螢光測量，它們是樣品定量和質量控制的互補測量技術。 UV-Vis 吸光值測量是生命科學實驗室中純化生物分子定量的標準方法。 該方法根據分子在特定波長下(220-360 nm)的吸光值曲線快速檢測分子(圖一)。

圖一：在 BMG LABTECH 微孔盤判讀儀使用 UV/vis 吸光值進行 DNA 定量(藍線：pure water ；紅線：DNA )

螢光測量是利用熒光團與核酸結合時發出螢光，並透過螢光分子與標準濃度核酸混合並測量相對螢光單位(RFU)以繪製出濃度與測量值之標準曲線，根據該標準曲線以確定未知樣品之濃度(圖二)。

圖二：在 BMG LABTECH 微孔盤判讀儀使用螢光進行 DNA 定量

BMG Labtech 利用超微量孔盤(Lvis Plate)、96 well 微孔板以及 384 well 微孔板在微孔盤判讀儀上進行 UV-Vis 吸光值測量和螢光測量(Qubit™ 和 Quant-iT™/PicoGreen™)以比較不同的測量方式(圖三)。

圖三：在 VANTAstar、FLUOstar Omega 和 CLARIOstar Plus 上比較 UV/vis 吸光值測量和螢光測量的 DNA 定量結果

由以上結果可觀察到螢光測量之 DNA 濃度範圍為 1 pg -10 μg，然而 UV-Vis 吸光值測量之 DNA 濃度範圍只有 10 ng - 10 μg。雖然螢光測量範圍遠高於 UV-Vis 吸光值測量，且有較高之靈敏度，只是因為螢光測量的準備時間以及測量時間比 UV-Vis 吸光值測量來得長，並且測量值較易受到溫度改變影響。然而，UV-Vis 吸光值測量雖範圍較低，但無需任何試劑並可直接進行測量，且測量速度快。 由此可見，吸光值測量和螢光測量兩者皆有優劣之處，因此需根據實驗中核酸樣品實際的狀況去選擇合適的方式。例如，若實驗中獲得的核酸樣品較為純淨且產量較高時，UV-Vis 吸光值測量為首選的方法。相反，若實驗中獲得的核酸樣品易受污染或產量較低時，卻較適合使用螢光測量，因為螢光測量可以檢測濃度比傳統吸光度低數百倍外，並且螢光分子與核酸具有高度特異性結合，因此可避免樣品中污染物對核酸定量造成干擾。

表一：UV/vis 吸光值測量和螢光測量之優劣之處

2023/02/24 次世代定序進行HIV抗藥性基因分析

愛滋病是由 HIV 人類免疫缺乏病毒 (Human Immunodeficiency Virus, HIV) 引起，HIV 為一種反轉錄病毒, 會破壞人體的免疫系統。HIV病毒侵犯 CD4+ T cell，後天性的細胞免疫缺陷，導致病人容易伺機性感染不同的疾病，最後嚴重則導致死亡。
HIV 又分為 HIV-1 與 HIV-2，人類大部分感染的是HIV-1，最早由靈長類動物傳染給人類，而且 HIV-1 突變率很高。HIV-1 病毒還可以分成不同的亞型，感染者體內可存在不同亞型的病毒株，且可能已有多重感染，不同的亞型還能夠進行重組。由於病毒不斷突變產生抗藥性，患者需不斷換藥，使現今更難預防與治療此疾病。 基因型的突變會影響藥物治療的效果，因此需要高靈敏度的檢測方法分析基因突變。
由於次世代定序 (Next Generation Sequencing, NGS) 的高靈敏度、高效率和識別低豐富度變異的優點，越來越多的 HIV 研究機構採用 NGS 技術進行抗藥性基因分型。 HIV-1 可以依照基因序列分為 M組、N組、O組等，其中 M組演化了至少8種的亞型，每個亞型以一個英文字母表示，不同的亞型重組後以流行重組形式 (Circulating Recombinant Form, CRF) 稱之。在台灣，以 M組的 B亞型最多，E亞型次之。我們已經得知某些亞型的 HIV 更具毒性，對不同藥物也具抗藥性，因此可以從這些基因變異進行 NGS 分析。
在 NGS 的應用中，我們需要確認檢測多位點基因變異的正確性，因此需使用生物材料參考標準樣品 (Biological Reference Materials) 。 Seraseq® 有販售HIV-1 多種基因型的生物材料參考標準樣品，多為臨床相關的突變。基因突變導致抗藥性病毒株的產生，這些突變也已被持續追蹤，在斯坦福 HIV 抗藥性資料庫和國際愛滋病協會的網站上亦會公布相關重要突變。醫療與科學技術的進步，讓我們更能監控病程，對人類社會盡一臂之力。
References: 1. Robertson DL, Hahn BH, Sharp PM; Hahn; Sharp. Recombination in AIDS viruses. J. Mol. Evol. March 1995, 40 (3): 249–59. PMID 7723052. doi:10.1007/BF00163230. 2. Dhar, D. V., Amit, P., & Kumar, M. S. In-Silico Identification of New Genes in HIV-1 by ORF Prediction Method. I. Res. J. Biological Sci., 1(7), 52–54 3. Nyamweya S, Hegedus A, Jaye A, Rowland-Jones S, Flanagan KL, Macallan DC. Comparing HIV-1 and HIV-2 infection: Lessons for viral immunopathogenesis. Rev Med Virol. 2013 Jul;23(4):221-40. doi: 10.1002/rmv.1739. Epub 2013 Feb 26. PMID: 23444290. 4. Guglielmi, Giorgia (2022-02-03). "Highly virulent HIV variant found circulating in Europe". Nature. doi:10.1038/d41586-022-00317-x. PMID 35115695. S2CID 246530234.
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