新知應用小學堂

2022/09
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2022/09/19 基因工程產品的內毒素去除方法

內毒素是一種存在於革蘭氏陰性菌外膜的脂多醣(lipopolysaccharide,LPS),由 O-antigen、core oligosaccharide和lipid A組成。雖然LPS對細菌來說主要是作為保護作用和組成結構,但對於生物體會引起發燒、腹瀉甚至死亡,因此目前對用於治療的相關藥物、器具及耗材都被認定需要做內毒素控管。LPS在結構特性上是具有淨負電荷的化學穩定分子,可以抵抗高壓、極端溫度和 pH 值,單體的分子量為10-20 kDa,在水溶液中,尤其當二價陽離子存在時,如 Ca2+ 和 Mg2+,可形成穩定的聚集體(Micelles)。當洗滌劑(Detergent)存在時,有助於將LPS聚集體分解成更小的結構(sub-units),是目前針對蛋白質樣品最常使用的LPS去除方法。然而當洗滌劑存在時,除了會影響樣品的純度與效能,可能會導致後續對於內毒素含量分析時的干擾,因此如何以最少量的去汙劑有效達到去除LPS,成為製程上的一個重要的衡量因素。
Adeno-associated virus (AAV)是一種將單鏈DNA (ssDNA)基因組整合到蛋白質外殼中的病毒,常用於將特定DNA遞送至目標細胞的基因工程試驗,被認為是基因治療最安全的策略之一。不過在整個試驗的過程中,非常容易受到來自一般實驗材料、環境中LPS污染,及最直接的是來自E. coil純化出的plasmid DNA。在文獻中顯示,以含有0.5%洗滌劑(Triton X-100 or Na-DC)並且經37 ℃預熱的PBS緩衝液,混合樣品後在37 ℃持續作用30分鐘,達2次處理,有助於將LPS從中分離。接著以高鹽(0.2M NaCl)緩衝液進行清洗殘留的洗滌劑達3次,以100 k的濃縮管(Sartorius # VS2042)在轉速2,000 xg下收集AAV。此流程有助於將 LPS 從大約 1,000 EU/mL 降低到低於 2.5 EU/mL 的含量。

圖一 Recombinant AAV樣品的LPS去除流程

在整個洗滌過程中,使用CMC-535™ Detergent Assay (G-Bioscience)進行洗滌劑定量,由於與 CMC-535™螢光染劑的相互作用,導致螢光信號的增強會與洗滌劑濃度成正比。此外該測定法與大多數水性緩衝液兼容,僅對於含有磷酸鹽的緩衝液除外,包括釋放磷酸鹽的分子(即 ADP 和 ATP)。因此在文獻中改以乳酸林格溶液(Lactated Ringer’s Solution)代替PBS緩衝液進行洗提流程,並且以Triton X-100在280 nm下的吸收特性去評估與定量,同時搭配標準稀釋曲線0.1%-0.0016%在 PBS-0.2 M NaCl 的控制組測定。發現在此洗滌流程之後,樣品中的Triton X-100殘留濃度低於 0.00003%,遠小於造成細胞毒性的濃度0.009% (0.15 mM)。


圖二 CMC-535™ Aaasy (G-Bioscience)是常用於洗滌劑(Detergent)定量分析的方法

內毒素的去除總是需要仰賴一系列的處理流程, 其中”各種類型的洗滌劑”是最常用到的方式, 為避免過多的洗滌劑殘留影響產品品質, 以最少量及最簡易的流程, 從源頭端降低使用量的方法是最有效的, 而這同時也有助於去除後續對內毒素檢測的干擾。

2022/09/30 H2O2滅菌確效新選擇- Apex EZTest自含式空間滅菌生物指示劑

Apex®生物指示劑產品是專門為使用過氧化氫H2O2蒸汽滅菌的製藥、食品和醫療器械工業所設計,304等級不銹鋼載體材質可應用到目前使用廣泛的隔離器和灌裝生產線,產品包含不鏽鋼圓片(Discs)、長型不銹鋼片(Ribbons),以及三階段菌數套組(Tri-Scale:104, 105 and 106 spores)。孢子皆以單層塗層技術置於不鏽鋼載體,避免當細菌孢子堆積在一起時,底層(或內層)的孢子可能難以接觸到H2O2,不鏽鋼載體也避免因吸收導致H2O2濃度難以區別的狀況。
Apex® EZTest是不銹鋼圓片為載體的自含式生物指示劑,設計用於H2O2空間滅菌。上方的景窗設計,讓氣化(或霧化)的H2O2可以直接進入執行滅菌流程,在測試過程中可以放置在任何位置,不會因方向性受到限制。滅菌後不須進行曝氣消散H2O2,即可直接培養使用;具輕巧耐用、防水且透氣特性的Tyvek®濾膜作為孢子載體與外界的阻隔,有效防止外來汙染又不影響H2O2通透性;壓蓋式設計,僅須以手輕壓即可將產品自含的培養基內管壓碎、密封上蓋,即可直接放入培養箱培養。當存在活孢子時,內含pH指示劑的培養基會轉變為黃色,可直接以肉眼判讀。

使用Apex® EZTest,您可以:
1. 在滅菌系統內隨意擺放
2. 最大限度地避免後續操作造成的汙染
3. 不需要額外準備培養基,大量減少庫存負擔


圖一 輕鬆操作Apex® EZTest,直觀判讀確效結果
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