2023/10

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BI 滅菌時間需要多久呢?

影響生物指示劑 (BI) 滅菌時間的主要變因為孢子數 (Population) 和D-Value (使菌數下降90% / 1 log 所需的滅菌時間)，MesaLabs 生物指示劑的 COA 上會列出 Population、Z-Value (使 D-value 改變10倍 / 1 log 所需的溫度差)、在一個或多個滅菌溫度下以專用滅菌器 (Biological Indicator Evaluator Resistomer, BIER) 所測得的 D-Value 和 Survival / Kill Time 等等數據，提供用戶端作為滅菌設備參數的依據，而當用戶端的滅菌溫度未列在 COA 上時，我們可以用 COA 上的 Population、D-Value 和 Z-Value 計算出該條件下的滅菌時間 (Kill time)，接下來會以 EZS/6 的 COA 為例說明與計算 (圖一)：



一、計算 COA 上的 ⁽²⁾Survival / Kill Time
依據 ISO 11138 和 USP 定義的算式
Survival time/dose = not less than the D-value x (Log₁₀ labeled viable test organism count per carrier – 2)
範例：1.7 minutes x (log₁₀ 2.6 X 10⁶ - log₁₀ 10²) = 7.51 minutes

Kill time/dose = not more than the D-value x (log₁₀ labeled viable test organism count per carrier + 4)
範例：1.7 minutes x (log₁₀ 2.6 X 10⁶ + log₁₀ 10⁴) = 17.71 minutes
代表孢子對數減少 Spore Log Reduction (SLR) 數量為 BI 孢子皆被殺滅後，存活孢子數不到0.001個。

二、計算理論殺滅時間
Theoretical kill time = (Log₁₀ N0 + 1) x D-value
範例：1.7 minutes x (Log₁₀ 2.6 x 10⁶ + Log₁₀ 10⁰) = 12.6 minutes
代表 SLR 數量為 BI 孢子數皆被殺滅後，存活孢子數不到1個。
結論：綜合法規算式和理論算式以及 BIER 實驗結果驗證，孢子殺滅時間為12.6 ~ 17.71分鐘 (圖二)。



三、計算未在 COA 上列出的溫度下孢子的理論殺滅時間
依據 ISO 11138 的算式，計算131 ºC 的 D-Value 和 Kill Time
D₁ = D2× 10^{(T2 - T1)/Z}
範例：D₁₃₁ = 1.7 × 10^{(121 - 131)/15.2} = 0.4 minutes

D₁ is the D-value at temperature T1 (e.g. the D₁₃₁-value)
D₂ is the known D-value at temperature T₂ (e.g. D₁₂₁-value = 1.7 minutes)
Z is the Z-value (e.g. 15.2ºC)

Theoretical kill time = (Log₁₀ N₀ + 1) x D-value
範例：0.4 minutes x (Log₁₀ 2.6 x 10⁶ + Log₁₀ 10⁰) = 3.0 minutes

滅菌時間除了可以參考 COA 上列出的 Kill Time，也可以用 Population、D-value 和 Z-Value 計算出符合用戶端需求 (例如時間效率或用戶所遵循的法規) 的滅菌時間。

介紹
生物製劑 (Biologics) 的製造是一個複雜且花費甚高的過程，通過該過程可以回收並純化蛋白質，去除污染物，以生產最終藥物產品。這是通過一系列過濾和層析過程完成的。實現和保持所需的產品質量和純度需要優化製程參數以及精確控制這些參數。
 
在整個下游製程中，測試和釋放緩衝液的傳統測量包括pH值和電導率。目前，通過程序控制 (例如標準操作程序 SOP) 以及通過結合 pH 值的間接測量來確保緩衝液成分濃度和電導率。pH值和電導率都是相互關聯的，具有分子特異性，並且取決於條件下分子的解離程度。
 
滲透壓在本研究中被評估為正交測量 (Orthogonal Measurement)，具有增加一致性和改進生物製程控制策略的潛力。滲透壓是每千克水中溶質摩爾數的量度，因此相對不受分子類型、電離度或pH值的影響。進行這項研究是為了了解滲透壓如何進行濃度測量，以及它如何與 pH 值和電導率的測量進行比較。
 
材料與方法
本篇研究中使用 Advanced Instruments的OsmoTECH^® 單樣品微滲透壓計測量滲透壓，該滲透壓計採用冰點降低法(Freezing point depression method)。
 
結果
下面的七組圖顯示了每組溶液三個屬性的平均值和 %CV (標示error bar)。Error bar 表示極小 CV 不可見。每組圖表的軸都進行了調整以突出趨勢。
(詳細數據請見完整文章)
 

圖1. 檸檬酸鹽緩衝液濃度曲線上滲透壓和 pH 值的比較。 y 軸擴展了整個 pH 範圍，以突出顯示檸檬酸鹽緩衝液濃度之間相對較小的變化。滲透壓計的靈敏度遠高於 pH 探針，如 pH 濃度曲線的低斜率所示。


圖2. 乙酸(弱離子溶液)的電導率在濃度為1 M 時急劇下降，並隨著濃度的增加而保持恆定。
 
討論
數據顯示，pH 值和電導率不能提供 Tris、乙酸、檸檬酸和檸檬酸鹽等緩衝液濃度的最佳測量值範圍。另一方面，滲透壓為上述緩衝液提供了成比例的廣泛測量值範圍。雖然電導率和 pH 值在下游生物製程中具有明確的價值，但滲透壓可以提供有關緩衝液濃度的更多信息。測量 pH 值在下游生物製程中至關重要；然而，它缺乏靈敏度，因為範圍在緩衝液濃度範圍內變化很小。
 
例如，檸檬酸鹽緩衝液(圖1)的 pH 的測量範圍為0.5，而滲透壓的測量曲線則約500 mOsm/kg H₂O。這是普遍趨勢，表明滲透壓提供了比單獨測量 pH 值更寬的動態範圍和更高的靈敏度。電導率通常在下游緩衝液和試劑中測量，因為它提供了離子溶液濃度的概念。它對非離子和弱離子溶液(如乙酸)不可靠。在1 M 濃度以上，乙酸的電導率保持在1 mS/cm 左右(圖2)，但這種影響並未反應在滲透壓測量中。
 
本研究證明了滲透壓作為常見下游緩衝液濃度測量的敏感性。這些數據支持滲透壓作為電導率和 pH 值的一個有價值的正交特性。由於滲透壓的敏感性增加，這將是幫助檢測緩衝液濃度或配方潛在問題的理想方法。鑑於測量的簡單性及其增加的價值，應考慮在下游製程工作流程中進行滲透壓測試，以提供更完整和全面的下游緩衝液製程數據。
 
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