2022/12

• 
• 
• 
• 

 人體的腸道內有大量的腸道微菌叢，而這些微菌叢的存在可以協助人體維持良好的免疫系統。而腸道中的菌叢以對人類優劣處來分類可分為腸道益生菌與致病性細菌。
     近期的文獻指出，若腸道微生態失衡 (Gut Dysbiosis)，也就是致病性細菌長期高於腸道益生菌，則會因菌叢生態失衡誘發長期的低度炎症 (Low Grade Inflammation)，持續的發炎性腸道疾病會導致慢性的發炎，可能會造成息肉增生和大腸直腸癌生成、肥胖和自體免疫疾病等。舉例來說，產生硫化氫的產硫菌若大量增生，擴散在腸道中的硫化氫可能會導致上皮細胞走向癌化。


        已有不少學者在探討腸道微生態失衡 (Gut Dysbiosis)的致病機轉，而RayBiotech提供研究者多套系統，具有完整的生產線的ELISA和 Antibody Array產品, 能夠大量快速進行分子生物探討，完整的生物分子偵測工具更能在了解分生機轉方面助一臂之力!


Raybiotech的優勢:

1. ELISA和Antibody Array產品線完整


2. ISO13485製造規格試劑


3. 適用樣品:血清、血漿、組織與各種液態檢體


4. 應用生物廣泛:Human、Mouse、Rat等等


5. 偵測靈敏度達pg/mL


6. No-Cross-Reactivity之高專一性抗體對


7. Biomarker最多樣且文獻豐富


8. 提供定性及定量分析產品                                                                                                                            

發炎反應會使免疫細胞分泌相關cytokines, 也會引起相關cell signaling pathway活化。


Wang Ji, Chen Wei-Dong, Wang Yan-Dong The Relationship Between Gut Microbiota and Inflammatory Diseases: The Role of Macrophages 1664-302X doi: 10.3389/fmicb.2020.01065
如上圖, 巨噬細胞參與腸道微菌叢和發炎反應的交互作用:
(A) 在腸道穩態下，骨髓來源的 Ly6C⁺ 單核細胞不斷被募集到腸道以補充腸道巨噬細胞（CD14^-巨噬細胞），後者通過 TLR4 受體識別病原體並分泌抗炎細胞因子 IL-10 以促進 Treg 細胞擴增。
(B) 在 inflammatory bowel disease ( IBD) 病患中，炎症環境導致腸道菌群失調，Ly6C⁺單核細胞被募集到腸道成為發炎性巨噬細胞（CX3CR1⁺巨噬細胞）並分泌促炎細胞因子如IL-23和TNF-α參與炎症反應。
(C) 在肥胖症中，High-fat diet飲食引起的腸道微生物群組成的改變導致腸道通透性增加， LPS 進入系統循環（即代謝性內毒素血症），脂肪組織的巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1ß。
RayBiotech亦有完整的發炎因子相關的ELISA kit 和 Array, 以下為已有相關文獻指出常見發炎反應的cytokines 和 cell signaling pathway markers 對應到RayBiotech貨號:


因腸道微生態失衡 (Gut Dysbiosis)引起的相關疾病如下:
發炎性腸道疾病inflammatory bowel disease (IBD)
類風濕性關節炎rheumatoid arthritis
第一型糖尿病type 1 diabetes mellitus
多發性硬化症multiple sclerosis
系統性紅斑性狼瘡systemic lupus erythematosus

Referennce:
Wang Ji, Chen Wei-Dong, Wang Yan-Dong The Relationship Between Gut Microbiota and Inflammatory Diseases: The Role of Macrophages 1664-302X doi: 10.3389/fmicb.2020.01065
 Jacobs JP, Goudarzi M, Singh N, Tong M, McHardy IH, Ruegger P, et al. A Disease-Associated Microbial and Metabolomics State in Relatives of Pediatric Inflammatory Bowel Disease Patients. Cell Mol Gastroenterol Hepatol (2016) 2:750–66. doi: 10.1016/j.jcmgh.2016.06.004
inha-Hikim AP, Sinha-Hikim I, Friedman TC. Connection of Nicotine to Diet-Induced Obesity and Non-Alcoholic Fatty Liver Disease: Cellular and Mechanistic Insights. Front Endocrinol (Lausanne) (2017) 8:23. doi: 10.3389/fendo.2017.00023

背景介紹
單細胞定序(Single-cell sequencing)使研究人員能夠定義異常細胞群(abnormal cell populations)，發現和分析稀有細胞、細胞圖譜網路(cellular map networks)，並發現細微但重要的異質性(Heterogeneities)。有鑑於其令人難以置信的潛力，單細胞定序技術出現爆炸式增長和需求也就不足為奇了。然而，單細胞定序需要大量的成本和時間投資。為確保時間和資源的投資獲得高質量數據的回報，樣本在處理前的品質便至關重要。

此外，由於所有單細胞定序protocol都仰賴在處理前準確量化細胞，故準確的細胞計數(accurate cell counts)是相當重要的第一步。因此，用於定量單細胞定序樣本的自動細胞計數器必須準確可靠地對所有樣本類型的細胞進行計數，包括解離組織(dissociated tissues)、分離的細胞核(separated nuclei)、全血(whole blood)和培養的細胞株(cultured cell lines)等。

本篇展示了 LUNA-FX7™自動細胞計數器如何為許多不同的樣本類型提供準確計數，而且同樣重要的是，如何驗證樣本質量。


圖1. Singe-cell sequencing workflow：1)組織收集，2)分離細胞製備，3)定序文庫(Library)製備，4)定序和5)分析。
 
【注意】
從整塊組織中製造適用於計數和單細胞定序的分離細胞(isolated cells)需要完全解離(complete dissociation)。細胞團塊(cell clusters)不僅會產生不準確的計數，還會對定序結果產生負面影響，加上每種組織類型的細胞外基質(Extracellular matrix, ECM)組成可能不同，因此，必須相應地優化解離方法的酶促(enzymatic)反應和化學成分，以確保從解離組織中獲得分離的細胞。
 
細胞樣本品質評估
本篇收集了兩種細胞樣品用於Singe-cell RNA-seq分析。使用標準細胞存活率protocol和 Acridian Orange/Propidium Iodide細胞染劑(Cat# F23001)對兩種樣品進行計數。第一種樣品是從人類外周邊血(Peripheral blood mononuclear cells,  PBMC)中分離出的B細胞，高細胞存活率和單顆細胞分離程度(圖2)適合下游文庫製備。相比之下，第二種樣品，即貼壁細胞AsPC-1，提供了一個範例，說明了基於圖像的準確計數器(accurate image-based counter)對於評估樣本製備的數量和質量之重要性。
 
收細胞後，AsPC-1細胞發生不完全解離(incomplete dissociation)。生成的圖像清楚地表明，很大一部分細胞含量仍被納入結合團塊中，比例高達9%，此時AsPC-1的存活率僅為56%。受存活率和細胞分離的影響，該樣品不適合下游處理(圖3)。在許多情況下，單個細胞的樣本細胞是有限的，需要低細胞濃度和重複計數才能獲得最佳和快速的細胞計數。在低濃度細胞的精確計數中，我們使用LUNA™ 1-Channel Slide (Cat# L72011)，即使細胞濃度低至1x10^4 cells/mL，它也能容納更大的細胞體積來計數(表1)。
 
分析完整細胞核
對於多種單細胞定序應用，需要進一步處理分離細胞以製造分離且完整的細胞核。本篇接下來評估了LUNA-FX7™的效用，以評估完全分離的細胞核之整體品質和數量。為此，本篇中使用了3種細胞株——HL60、HeLa 細胞和 HEK 細胞。圖4顯示了包含完整、健康的 HL60 細胞(左)、核部分分離的HL60細胞(中)和核完全分離(右)的3種圖像，具有完整細胞膜的活細胞在AO染色中顯示綠色螢光。相比之下，死細胞和分離的細胞核都會通過破損或缺失的細胞膜涉入PI而發出紅色螢光。然而，LUNA-FX7™允許您使用細胞大小(cell size)資訊分辨完整的死細胞與完整的細胞核(圖4，圖6)。例如，完整HL-60活細胞的平均細胞大小為13.4 μm，完全分離細胞核的平均大小為8.3 μm，表明細胞膜和細胞質部分已成功去除。不完全分離的核大小平均為10.2 μm，表明分離核的品質不足以進行下游處理(圖4)。
 
此外，LUNA-FX7™的高解析度明視野圖像可用於目視驗證分離核的質量。例如，分離的細胞核可以很容易地與完整的細胞區分開來，因為細胞核的邊界更薄，並且由於缺乏細胞膜而不明顯。(圖5和圖6)。
 
綜合以上，LUNA-FX7™在三通道成像(BF、GF和RF)中的功能和靈敏度，以及復雜的標記演算法(sophisticated tagging algorithm)，使您能夠在進行昂貴的下游定序處理之前建立樣品通過或失敗的品質管控標準。


圖2. 充分製備的B細胞可應用於單細胞文庫，包括所有無死細胞(RF)或顆粒碎片(BF)的陽性綠色細胞，具有100%存活率的優良標記。這些健康細胞的平均細胞大小為10.7 μm，細胞簇圖(cell cluster plot)中100%分離單細胞，濃度為 3x10^5 cells/mL。


圖3.用於單細胞定序的未充分準備之細胞樣本範例，不適合作為單細胞定序樣品AsPC-1細胞。“失敗”的細胞製備展現死細胞含量高與含有未完全分離的細胞團塊。LUNA-FX7™的簇直方圖(cluster histogram)功能允許準確評估細胞團塊與分離細胞之百分比。


圖4. HL 60細胞核分離過程的可能結果。明視野(BF)圖像和帶標籤的疊加螢光圖像讓您輕鬆區分不同的細胞“狀態”。在BF圖像中，完整的細胞比分離細胞核明顯更突出、更暗。同時，螢光圖像和計數可以進行準確的定量評估。


圖5.區分活細胞核、死細胞核和完整細胞核。因為死細胞和完整的細胞核都缺乏完整的細胞膜，所以紅色螢光會從PI染色中被偵測到。由LUNA-FX7™生成的BF圖像和尺寸測量能夠常規區分死細胞和完整的分離細胞核。


圖6.分離細胞核的評估和可能的結果。明視野(BF)圖像和疊加的螢光圖像讓您可以輕鬆區分不同的細胞“狀態”。與BF圖像中的分離細胞核相比，完整細胞明顯更加突出和更暗的邊界。同時，螢光圖像和計數可以進行準確的定量評估。活的完整細胞用AO染色(GF)，分離的細胞核被染成紅色。LUNA-FX7™ 可以準確區分具有大細胞質和小細胞核(HeLa)的樣品以及相對於細胞質具有大細胞核的細胞類型(HEK293)。


表1.計數玻片選項及規格。

結論
對於單細胞定序，LUNA-FX7™為研究人員提供了提高細胞樣本準確性和可靠性的新面向，以評估各種樣本類型中細胞和分離細胞核樣本的數量和品質。
 
REFERENCES

1. L., Xiong, F., Wang, Y., Zhang, S., Gong, Z., Li, X., . . . Guo, C. (2021). What are the applications of single-cell RNA sequencing in cancer research: a systematic review. J Exp Clin Cancer Res, 40(1), 163. doi:10.1186/s13046-021-01955-1


2. Dong, X., Liu, C., & Dozmorov, M. (2021). Review of multi-omics data resources and integrative analysis for human brain disorders. Brief Funct Genomics. doi:10.1093/bfgp/elab024