2022/06

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FiberCell中空纖維生物反應器被認為是連續大量生產細胞外囊泡(EVs)的重要工具，在2021年發布的一份綜合研究中，表明此系統可以收集到相同質量和數量的EVs，除了對於培養過程前、中、後期EVs的大小與濃度分析外，更進一步確認相關的表現性與功能性特徵。
 
研究人員發現，中空纖維生物反應器內部的人類骨髓間質幹細胞(hBM-MSCs)，除了保持高活力，還保有其三系中胚層分化能力，並且同時表現MSC相關標記。其中CD9、CD63 和CD81在EVs生產過程中一直被檢測到，證實了hBM-MSC在生物反應器條件下產生的EVs身份。針對EV、幹細胞和免疫相關抗原的37個Epitopes進行偵測，不同的3個時間點(第1、13和25天)所收集的EVs，多帶有共同的Epitopes，且MSC 已知Epitopes也通過antibody-bead conjugates在 EV 樣品上檢測到，包括 CD44、CD146、CD29、MCSP、CD49E 和 CD105。第13天和第25天，CD105、CD49E、CD9、CD40、CD81、CD29 和 VEGF-A和Glycan-binding-lectins (ConA、LCA、AAL、ECL、PNA和RCA)的表現與第 1天有統計上的差異，這表示在第13-25天之間可能是一個理想的生產狀態，可獲得一致性EVs。



另外針對29 種細胞因子/趨化因子和生長因子(稱為炎症和免疫反應的生物標誌物)，對EVs的內含量進行分析，並且在4個不同來源、不同的3個時間點(第2、14和24天)都檢測到 IL-6、IL-8 和 VEGF-A 因子。其中VEGF-A蛋白量從第 2 天(106.2±45.8 pg/mL/μg)到第24天(38.0 ± 10.2 pg/mL/μg)觀察到下降的趨勢 (p < 0.0001)。

GMP Biomanufacturing Solutions - Walk the hall of Getinge Applikon following a stainless steel project
 
用於GMP的商業規模不銹鋼生物反應器需要針對每個特定製程進行調整。Getinge，前身為Applikon Biotechnology，30多年來一直是不銹鋼生物反應器系統值得信賴的合作夥伴。該網絡研討會提供了一個窗口，讓您了解典型的不銹鋼項目是如何在位於荷蘭代爾夫特(Delft NL)的Getinge Applikon製造基地生產製造的。
 
Webinar內容

• 項目開始，銷售轉移到項目經理


• 系統設計和相關技術圖紙與工程


• 生產線的組裝和驗證


• 帶 QC 的工廠驗收測試 (FAT)

日期：2022.6.15 (三)
時間：台北時間23：00，45分鐘，含Q&A
報名連結：GMP Biomanufacturing solutions: Walk the halls of Getinge Applikon following a stainless steel Project

歡迎生物製造專業人士與對不銹鋼生物反應器產程放大(Scale-up)感興趣的您！

細胞培養是再生醫學細胞製造中最重要的過程，眾所周知，細胞特性在此過程中容易波動（內部紊亂），進而影響產品質量。
 
培養基成分的測量是一種經過驗證的非侵入性方法，該方法已被開發與採樣技術相結合的在線測量(on-line measurement)技術。與微生物、植物細胞和許多動物細胞的培養不同，人體細胞培養經常需要更換培養基，這主要不是因為培養基成分耗盡，而是因為乳酸(lactic acid)和氨(ammonia)等有毒成分的分泌會抑制細胞生長。因此，從過程控制的角度來看，利用廢培養基進行分析以確定培養趨勢是一種非侵入性和通用的方法，無需添加新的過程即可使用。
 
Nova Biomedical實驗室先前已證明，具有三維結構的上皮組織（表皮和角膜上皮組織）的多層培養物中培養基成分的波動可用於了解上皮組織的狀態，並且最近已將這一經驗應用於大規模生產的iPS細胞聚集體的懸浮培養。
 
在本次Webinar中，將分享培養基分析技術及其在iPSC等研究領域的應用與經驗。
 
時間：2022/6/21(二)，台灣時間19：00開始
Webinar網頁連結：請點我
 
歡迎所有對細胞培養，培養基分析，與細胞治療研究與應用領域的專業人士與操作者一同參與！

 而核酸最常會受到有機溶劑、蛋白質、多醣、酚類等污染物污染，而因為因為蛋白質及酚類物質的最大吸收光在280 nm；多肽、芳香基團、苯酚和碳水化合物的最高吸收光在230 nm， 因此檢測核酸萃取物是否受到污染物污染，常會通過掃描樣品230、260、280 和 340 nm的吸光度，並通過計算 260/280 和 260/230 比值來評估核酸樣品純度質量。 

BMG Labtech 為了了解不同的污染物在核酸的影響，在250 ng/ul 的DNA 中分別加入不同的污染物，如 guanidine HCL、sodium acetate、phenol(苯酚) 、BSA 和澱粉(Starch)，並進行230、260、280 和 340 nm的吸光度檢測。實驗結果發現，加入污染物後的DNA光譜曲線有明顯的改變(圖2A)，並且其260/280 和 260/230 比值皆低於理想值(圖2B)

因此當A260/280(DNA: 1.7-1.9 ; RNA: 1.8-2.0 )或A260/230(DNA: 2.0-2.4;RNA: 2.0-2.4)沒有在理想值，可能要考慮核酸是否已受到蛋白質、多醣、酚類等污染。

 然而，除了A260/280或A260/230比值會受污染物影響外，美國New England Biolabs(NEB)有進行測試證明了核酸樣品的過低時，A260/280及A260/230的比值也會出現異常。NEB利用150 ng/µl 至 1 ng/µl 不同濃度的DNA在超微量分光光度計上進行檢測。在是次測試中，NEB發現若DNA樣品濃度低於20 ng/µl 時，其A260/280及A260/230比值並不可靠，並且對於DNA樣品濃度在 20–50 ng/µl 之間的A260/280及A260/230比值變化亦很大(圖3A-3B)。



由以上結果可得知核酸的品質可藉由A260/280及A260/230比值來作判斷，當比值沒有在理想範圍中，核酸可能已受到蛋白質、多醣、酚類等污染，但當核酸濃度過低時，其相關的比值只能當作參考，並不能完全代表核酸的純度。

參考資料:

1. D Ann-Cathrin Volz BMG LABTECH . “DNA purity ratio – fast and easy absorbance-based evaluation of nucleic acid quality. ”(2021).


2. Koetsier, Giron and Eric J. Cantor. “A Practical Guide to Analyzing Nucleic Acid Concentration and Purity with Microvolume Spectrophotometers.” (2019).

隨著科技的發展，冷光(luminescence)相關的分析實驗開始廣泛的應用於不同的檢測上，如報導基因 (Gene reporter assay)、細胞存活率 (Cell viability)、 蛋白質交互作用(Protein-protein interaction)等檢測。雖然冷光檢測可在多孔盤式判讀儀上進行高通量、高靈敏度且大動態範圍的偵測，但在進行冷光檢測時，串擾效應(cross-talk effect) 會影響冷光測量，而這現象是無可避免的。

由於在冷光反應中產生的光是漫射光，因此光不僅可能會照射到檢測器上，還有可能穿透到相鄰的well中，這會導致信號的偏差、更高的信號變化和更低的整體靈敏度 (圖 1)。


 
為了減少漫射光的影響，不少多孔盤式判讀儀使用孔徑遮光的物理阻擋方式隔離不需要的光。而BMG LABTECH的盤式判讀儀是利用一個黑色的勺形配件(Aperture spoon)以隔離不需要的光(圖2A)。因此在偵測時，well中的信號可透過Aperture spoon中間的小孔傳達到檢測器，而其他不需要的光卻被阻擋住。

光線除了直接照射到檢測器外，還可以穿透孔壁傳遞到相鄰的well中。因此BMG LABTECH的盤式判讀儀還具備串擾校正功能(cross-talk correction)，以數學運算的方式校正測量信號，降低光線穿透孔壁造成的影響。

BMG LABTECH利用了96-well白色孔盤、96-well黑色孔盤和96-well灰色孔盤進行BacTiter-Glo™檢測以評估了光線在不同孔盤壁穿透的能力及影響。

首先，偵測相鄰皆為空白樣品的well(圖 2B-1)再與旁邊為高濃度 ATP 的well(圖 2B-2)進行比較。


 
在偵測後透過串擾校正功能(cross-talk correction)計算得出白色孔盤的校正因子為 0.05353%，灰色孔盤的校正因子為 0.01277%，黑色孔盤的校正因子為 0.00026%。從以上結果得出孔盤的顏色會影響串擾效應的程度，孔盤越深，串擾越低。
 
綜合以上結果可了解到雖然白色孔盤因具有反射作用，能提供較強的信號，但它們也增加了串擾效應。因此灰色孔盤提供了串擾減少和信號反射之間的折衷方案。除了選擇適合的孔盤外，使用合適盤式判讀儀也是可提升數據的質量，BMG LABTECH 的盤式判讀儀透過利用勺形配件及串擾校正功能，以物理阻擋方式及數學運算的方式以最大限度地減少串擾效應的影響，為您提供最佳且高品質的檢測數據。