新知應用小學堂

2022/07
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2022/07/11 獲得優質細胞與有效的實驗數據? 從把細胞養好開始!!

從基礎的細胞培養把關細胞品質
細胞培養是所有實驗的基礎,首先必須要有穩定的培養狀況,才能區別、判定差異性,也才能將測試結果實際應用到治療、製程等應用層面。一般來說,細胞培養所需的基本條件為氣體、溫度與培養基,前2者藉由CO2培養箱穩定運行,培養基的部分在大多時候是需要由操作者依據不同細胞株,以進行半客製化,其中主要著重於下列幾項主要成份。
(1) 5-20% 血清
細胞種類多元,一般難以將每種細胞所需的營養進行100%解析,使用動物血清進行培養,是目前供給細胞營養豐富度的重要來源。血清中提供許多必須營養素(Protein, Lipid etc.),並且含有許多生長因子和激素(Growth factors, Hormones),能夠幫助細胞貼附、維持培養環境的穩定(pH, Osmolality, surface tension, Viscosity),更有助於提高生長細胞數、增加存活率、延長繼代數,以及使細胞型態與Cell marker表現穩定。
其它操作建議:
關於血清的那些事兒(一) 血清中的沉澱
關於血清的那些事兒(二) 反復凍融對血清的影響
關於血清的那些事兒(三) 和血清熱去活化說 No
(2)基礎培養基
隨多年的測試與研究發展,大部分已知且可自行製造的營養物配方已經發展成商業化的基礎培養基,其中包含各種成分與比例的碳源(Glucose、Sodium Pyruvate)、胺基酸、維生素、無機鹽類。並且以不同緩衝效能的buffer為基底,其中添加HEPES與Sodium Bicarbonate中和CO2溶於液體造成的酸性(低pH值)及緩衝pH。
(3)抗生素
細胞由於沒有細胞壁,因此對於大部分的抗生素具有抵抗性。剛分離的細胞有潛在汙染源或是怕環境、操作造成汙染時,可以添加抗生素在培養基中做為預防性措施。一般針對細菌汙染常用的是penicillin/streptomycin二合一混合液,若是對於真菌/酵母菌可以選用penicillin/streptomycin/amphotericin B三合一混合液。

圖一  培養基組成一般由操作者依據不同細胞株進行半客製化。

此外,細胞的最外圍僅有薄薄的細胞膜,因而是敏感且脆弱的,因此在備置細胞培養基或是會直接接觸細胞的溶液時,都會特別留意pH範圍應介於7.1-7.4、滲透壓(Osmolality)介於310-340 mOsm/kg,血紅素(Hemoglobin)會造成鉀離子濃度上升,改變細胞生理活性,如細胞內外滲透壓、電解質平衡、酸鹼平衡等,所以建議控制在≦10 mg/dL。其它像是內毒素(Endotoxin)因為會對細胞造成毒性、或可能造成不必要的細胞分化,一般也建議控制在≦10 EU/ml。
凍存流程控制以延續優質細胞
細胞冷凍是細胞培養技術的關鍵步驟,選擇合適的細胞狀態、收集細胞、確認細胞品質、到凍存液的選擇與冷凍品管理,都會影響細胞的活性及其表現。不當的冷凍和解凍步驟會降低細胞的存活率,更可能改變細胞特性,而使得試驗前後無法連貫。
凍存建議在細胞最健康活躍,也就是在對數期(Log phase)進行,細胞密度則建議落在1-2 x10^6 cells/ ml,只需以Condition medium:凍存液=1:1的混合,以(1)約1分鐘降1℃的速率緩慢降溫,或(2)置於抗凍盒內後移置-80℃至少24小時,之後再移置液態氮中以低於-130℃的溫度下進行長時間的保存。取出凍存的細胞後,置於37℃的水浴槽中溫和地搖晃加速回溫約1-2分鐘,低速離心去除抗凍液再以10倍稀釋加入Fresh medium,活化後的24小時內為細胞存活率的低點,過了24小時後細胞便會逐漸恢復活性。
其它操作建議:
解凍細胞大解密


圖二 冷凍在HyCryo-STEM凍存液中的細胞仍保有其分化能力的特性。

全球領先的細胞培養產品供應商--HyClone
HyClone從1975年開始致力於血清、液體和粉末培養基、製程液體和液體處理系統的製造,以完善的質量體系、製造流程和優質產品,作為全球領先品牌支持生物製藥的研究和生產需求。
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2022/07/25 循序漸進地細胞馴化,有效達到細胞培養的最終目標

不論是多重實驗條件的測試,或是以細胞量/產物量放大為目的,對於細胞來說,通常會是環境變異的大考驗,因而導致細胞數/活性/表現可能不如預期。為了把握每一次的實驗,一般建議進行循序漸進的條件轉換,也就是小幅度變化的條件改變,這個過程稱作”細胞馴化”。舉例來說,想降低培養基中血清做測試時,將原來血清20%的比例,下降為15%,確認細胞生長狀況穩定後,再降為10%去測試觀察,這就是小幅度的條件改變。
馴化狀況的評估與觀察建議是以2代細胞為區間,其中包含幾個基本建議:
(1) Cell viability > 90% 維持2代再轉換測試條件。
(2) 觀察Doubling time隨代數的變動,若以同樣條件連續2代都不斷延長,則可能需要以最初的原有條件培養,並增加該細胞所需的專一營養物。反之,若是在細胞型態上不改變的情況下,慢1-2小時則建議以相同的培養條件再看1代細胞,此時若doubling time不再增加,則表示已初步抓到一個適合的條件。
(3) 以高於一般繼代時的細胞數完成seeding,並且每一次繼代培養時都是。舉例來說,實驗室平常培養時,是seeding 3-5x10^5 cells/ml,做馴化測試時則提高到1-2x10^6 cells/ml,且以同樣的細胞數繼代到第2代。當連續2代viability都維持90%以上,且要以相同條件繼續測時,可以下降細胞數/若要再換另一條件,則仍seeding較高的1-2x10^6 cells/ml。
(4) Morphology觀察上,若僅為微小的變化,而Doubling time/Cell viability 維持良好,則觀察2代後,仍可以再進行下一階段的條件測試。
(5) 每隔2代的馴化後細胞建議都進行凍存,若是已知較為敏感的細胞,則建議觀察至少3代再做保存與下一階段的測試。
馴化的概念,其實也可以應用在一些初步的測試上,例如細胞實驗常會做血清測試,當使用不同來源的血清時,因為營養豐富度可能並非完全相同,所以細胞在測試的第1代時,可能會有doubling time改變的狀況,一般到第2代培養時就會接近原來的培養狀態。另外,在以細胞進行的製程上,例如抗體、蛋白藥生產,都會在製程規劃的階段進行馴化測試,穩定細胞的培養狀況並且優化成專門產生特定產物的條件。
將在製程上直接應用,或是未來打算往製程方面發展時,在前期馴化時就會使用非動物性來源(Animal-derived component free,ADCF)的材料,因此一般細胞培養時,會用到的豬來源trypsin可能就會以ADCF等級的HyTryp取代(重組蛋白酵素,對細胞溫和且具有與豬來源trypsin相同效能);使用ADCF等級的HyCryo凍存液將馴化好的細胞長期保存;使用Serum-free medium (SFM)進行製程培養,每一批次產程皆穩定。

圖一  HyClone製程產品為全世界藥廠、疫苗廠愛用且長期指定款。

其它製程優化與應用:
CHO 細胞代謝轉移的影響、調控及其在饋料批次培養工藝中的應用
單株抗體_mAb_生產CHO細胞系的分批饋料培養製程建立及優化
用於 HEK 293 细胞培養的 HyClone培養基

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