新知應用小學堂

2021/06
  • Facebook
  • LINE
  • X
  • LinkedIn

2021/06/07 使用Sartoclear Dynamics過濾系統進行慢病毒載體的澄清和收穫!

目前已有三千多項關於病毒載體正在進行臨床試驗,其中約10%是以慢病毒載體進行的。慢病毒載體通常是透過多種質體載體瞬時轉染到HEK293T細胞而產生的,病毒會釋放到上清液中,因此要將細胞培養液中的細胞/雜質移除,而在CAR-T研究中則是缺乏建立LV澄清的黃金方法。常規標準使用以離心機分離再進行上清液微孔濾膜澄清,但是僅透過單一步驟的過濾再加上DE助濾劑的輔助,將可有效捕獲和澄清LV,且提高LV純化和T細胞轉導效率。
實驗目的和總結:   主要使用含有矽藻土(DE)之Sartoclear Dynamics® Lab V50來澄清懸浮細胞HEK293產生的慢病毒載體(Lentiviral vectors, LV),透過使用實驗設計(DOE)分析Sartoclear Dynamics®Lab V50和與標準法比較,結果發現:
1. 高濃度DE雖降低感染力價,但有利降低濁度和加快過濾時間。 2. 較低濃度DE有利回收高LV力價。 3. 與標準法比,Sartoclear Dynamics®Lab V50可更好的將濁度/汙染物降低、提升過濾能力和提升整體膜的使用容量。 4. 相比標準法,更快、更安全進行處理,且減少耗材使用量。 5.  Sartoclear Dynamics®Lab V50適用於捕獲和澄清慢病毒載體。  
實驗結果:
一、使用MODDE® software (Sartorius)在DOE研究中評估DE濃度和接觸時間對濁度、感染力價和過濾時間的影響: 1. 當DE濃度升高,感染力價呈線性下將。 2. 隨著DE濃度的增加,過濾時間減少。 3. 隨著樣品與DE的接觸時間越長,濁度線性降低。
  二、評估Sartoclear Dynamics®Lab V50對處理時間的影響: 1. 使用標準法,大約25ml後,第一個Sartolab®RF50過濾器堵塞,因此需使用第二個Sartolab®RF50將剩餘液體過濾,費時費力。 2. 使用Sartoclear Dynamics®Lab V50因不需再進行離心,可有效降低總處理時間3.8倍
  三、評估Sartoclear Dynamics®Lab V50對濁度和過濾器容量的影響: 1. 標準法:濁度可至43NTU (89 %降低)。 2. 使用Sartoclear Dynamics® Lab V50 (5g/L DE),可將濁度降到21NTU(95%降低)。 3. 搭配最少量5g/L之DE,來確認澄清過濾器的容量,直到過濾阻塞為止,發現Sartoclear Dynamics®Lab V50 可裝置超過50ml的容量,標準僅約過濾33ml時發生阻塞。  
四、評估Sartoclear Dynamics®Lab V50去除雜質的影響: 1. 約10 g/L的DE會增加蛋白質和dsDNA的移除。 2. 10 g/L~40 g/L之間的較高DE濃度,移除能力沒有明顯增加。 3. 與常規離心後,再澄清方法相比,不論DE濃度為何皆顯著提高雜質移除濾。  
★最後跟大家複習如何操作Sartoclear吧!
將矽藻土倒入細胞培養液中進行均勻混合→將過濾裝置與真空馬達相連接→將含有矽藻土之細胞培養液倒入過濾裝置→真空過濾→過濾即完成。  
原廠商品資訊請點我

2021/06/25 RayBiotech及岑祥檢測實驗室提供您取得高品質的Protein Screening數據

岑祥所代理的RayBiotech原廠通過醫療器材製造認證ISO13485,且符合GLP/GMP FDA相關法規,為全球第一研發生產抗體陣列 (Antibody Array),至今應用多樣及文獻豐富;岑祥代檢實驗室通過RayBiotech認證產品操作實驗室,並被授權提供原廠Antibody Array及ELISA等全產品線試劑代檢服務。


Fig. 1 岑祥檢測實驗室RayBiotech產品代檢服務授權書

多數細胞生物機制 (Biological process),如細胞凋亡、炎症、血管生成、免疫反應和遷移,往往伴隨著細胞因子蛋白表達量的變化。 由於細胞因子之間互相干擾的可能性,因此必須通過多重分析獲得對生物反應和功能的完整分析。 與 ELISA 和Western blots相比, Antibody Array可以同時了解蛋白質活性及蛋白量。

Antibody Array篩選除了能提高了發現與細胞因子訊號傳導相關的關鍵因素、疾病機制或生物標誌物的機會;也能協助建構蛋白質表現圖譜更能確實反映現階段個體的細胞活性,並與疾病診斷 (Diagnosis)、預後 (Prognosis) 及治療後反應追蹤 (tracking treatment response) 的各階段的表現。

廣泛的蛋白質分析和生物標誌物研究工作已經確定了數千種潛在的蛋白質生物標誌物;部分生物標誌物已被驗證並獲得美國食品藥物管理局(FDA)批准用於臨床協助病程判斷;然而生物標誌物的發現進展及其驗證之間仍有一段差距,主要缺乏分析有效性及臨床有效數據的累積,而擁有高靈敏度且Multiplex assay的抗體陣列 (Antibody Array) 則是目前最有助力的分析工具之一。

RayBiotech Antibody Array有semi-quantitative array 及quantitative -Quantibody® Array產品線,不論是單張NC membrane或是Quantibody® Array在玻璃晶片上,單一個樣品能同時半定量數十至上百個蛋白,且每個蛋白測定採四重複驗證*,以達到數據驗證;Antibody Array皆達到pg/ml的偵測靈敏度並提供相對應的ELISA 產品做為交叉驗證的工具;適用樣品包含cell lysate、cell supernatant、serum、plasma、tissue lysate及其他多種生物液態檢體 (Body Fluid) ;適用樣品則包含人類、大鼠、小鼠甚至是大型實驗動物皆有,並提供客製化產品服務。(*部分產品為三重複驗證)



Fig. 2 Antibody array images 左為化學冷光偵測的 membrane-based array;右為螢光偵測的glass slide-based array


在我們多年代理及代做服務經驗下,常見的問題是因為不熟悉產品而怯步嘗試Array,其實Array並不如大家想像的難以上手,以membrane-based array為例,原廠有完整的配件附件,操作過程與一般拿取membrane的習慣一樣,只要輕柔操作每一個步驟,包含加樣、wash等。

該篇來分享membrane-based array實驗結果常見的問題及解決辦法給大家:
(1) 背景雜訊過多

Array 實驗跟其他蛋白質實驗一樣,樣品的前處理及其新鮮度都是實驗品質的關鍵,取的新鮮保存條件一致的樣品為首要條件,其萃取條件建議保持處理全程低溫及使用適用的萃取試劑,血液檢體則是在採血後盡速離心分離出serum/plasma,並建議以條件較為單純的血清Serum為選擇;而操作過程會經過加樣、培養、清洗等步驟都需要在適當的液態體積、震盪轉速、培養時間和溫度、清洗次數等,建議實驗室備有蹺蹺板式震盪器,而RayBiotech實驗配件中備有專用的membrane培養槽及玻璃晶片專用的離心管都讓操作者便於操作,適當的培養及清洗的震盪條件及實驗溫度都能有效改善背景雜訊的相關問題,Fig. 3為我們為客戶的樣品重新調整之後的實例。


Fig. 3 (A)為客戶第一次之結果 (B)為重新培養抗體等條件調整後之結果

(2) membrane背景不一致
操作過程中及呈色前讓membrane乾掉,或是呈色時ECL呈色劑分布不均勻或是過多所導致membrane影像背景不一致的主因。
(3) 整體訊號過於微弱

可能來自於樣品本身訊號極為微弱,可適當延長樣品及streptavidin試劑的等步驟的培養時間,至多可延長至4℃培養overnight。

以上調整方法可以有效改善影像結果,另外我們建議搭配較高階的CCD照膠系統及專業的分析軟體則能協助各位研究者有效完成數據分析。
岑祥全方位的產品皆可提供各位研究工作者取得最適當的實驗數據結果,而岑祥檢測實驗室同步提供相關服務,歡迎與全台灣岑祥業務團隊洽詢,我們將協助研究工作者們找尋最適合的產品服務。
岑祥檢測實驗室服務詳細資訊請點入連結 https://ppt.cc/fTzRYx